Desarrollos analíticos para la evaluación quimiométrica del origen geográfico y otras propiedades de cereales basadas en su perfil elemental

Jorgelina Zaldarriaga Heredia

2020

Doctorado en química
Universidad Nacional de San Luis
Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia

Primera edición - EPUB2.0 - ISBN 978-950-863-491-7

Editorial EdUNLPam - 22.05.2023

Jorgelina Zaldarriaga Heredia
Desarrollos analíticos para la evaluación quimiométrica del origen geográfico y otras propiedades de cereales basadas en su perfil elemental / Jorgelina Zaldarriaga Heredia. - 1a ed. - Santa Rosa : Editorial de la Universidad Nacional de La Pampa, 2023. Libro digital, EPUB - (Publicación de tesis o trabajos finales de grado, tesis de maestría, tesis de doctorado y trabajos) Archivo Digital: descarga y online ISBN 978-950-863-491-7 1. Química. 2. Cereal. 3. Tesis Doctorales. I. Título. CDD 664.72002
Archivo Digital: descarga y online
ISBN 978-950-863-425-2
1. Título.
CDD 306.09

TÚ PUEDES.

Mantente alejado de la gente que
intenta menospreciar tus ambiciones.
La gente pequeña siempre hace eso,
pero la gente realmente grande te
hace sentir que tú también puedes ser grande.

Mark Twain.

Muchas veces miré el cielo y
me dije: “Sé que fuiste vos,
gracias”.

A María Delia Pastor

AGRADECIMIENTOS

Quiero agradecer a aquellas personas que estuvieron en cada paso y cada momento todo este tiempo:

A mamá y papá. Mis héroes y grandes amores. Porque gracias a ustedes soy lo que soy. Gracias por siempre apoyarme y darme todos los recursos necesarios para que estudie y me forme como profesional. Gracias por su apoyo constante, por sus consejos y compresión, por todo su amor. Gracias por estar en esos momentos en lo que todo era gris, nunca dejaron que me diera por vencida y siempre me dieron ese aliento que necesité para continuar. Me han dado todo lo que soy como persona, mis valores, mis principios, mi empeño, mi perseverancia y mi coraje para conseguir mis objetivos y cumplir mis sueños. ¡Eternamente agradecida a ustedes, LOS AMO!

A mi familia. A mi hermano, mi tíamiga Silvi y mi amor Leo. Mis sostenes, gracias por acompañarme en cada decisión y por estar siempre al pie del cañón.

A José, mi director. Quien como profesor durante mi carrera me invito a que me uniera a este mundo de la ciencia. Siempre te estaré agradecida por cada oportunidad que me has dado y cada meta que me has propuesto alcanzar. Gracias por tus charlas y consejos que me han hecho crecer no solo como profesional sino como persona. Gracias por entenderme y acompañarme en cada momento.

A Raúl, mi codirector. Por su colaboración en esta tesis.

A Silvana. Gracias por darme el empujón que necesitaba. Gracias por estar ahí ¡vos sabes! Gracias por todas las charlas y consejos que me devolvieron la confianza. Gracias por contagiarme tu entusiasmo, por alentarme a seguir por más. Sin dudas has sido y sos un pilar un muy importante para mí.

A mis amigas. Camila, la mejor amiga que me dio la Universidad. Sin dudas agradecerte por estar siempre, en TODO. No hace falta decir más. Daniela, quién sin conocerme me hizo parte de su familia y me abrió las puertas de su casa. Gracias por hacer más divertida mi estadía en San Luis. Dicen que las distancias separan cuerpos, pero no corazones, te extraño y estás siempre presente en cada momento.

También agradecer a la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la Universidad Nacional de La Pampa, principalmente mi segunda casa el Departamento de Química lugar donde desarrolle mis tareas para poder llevar a cabo esta tesis, a la Universidad Nacional de San Luis qué también me brindo sus instalaciones y al Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET) por la Beca Doctoral otorgada para poder realizar este trabajo.

RESUMEN

La preparación de muestras es una etapa decisiva en el procedimiento analítico. El maíz posee una matriz orgánica compleja, debido a su alto contenido en almidón, grasa y fibra, por lo que requiere una mineralización por horno microondas antes de la introducción al MP-AES. Como alternativa al pretratamiento de muestras convencional, esta tesis propone un tratamiento de muestra rápido y simple, mediante mineralización de grano seco y molido con HNO3 y posterior calentamiento empleando ultrasonido, acelerando los tiempos de análisis y mejorando el rendimiento y la productividad.

Por otra parte, la composición multielemental constituye un importante indicador de la calidad de los cultivos en relación con factores de estrés fisiológico, así como para la salud humana, siendo significativo en los sistemas biológicos y en la calidad final de un producto. Se realizó el análisis multielemental en MPAES de muestras de granos y hojas de maíz y los datos analíticos obtenidos fueron analizados por programas quimiométricos en los que se evaluó la existencia de grupos de muestras que presenten respuestas similares según la concentración de los elementos analizados. Se han obtenido modelos clasificatorios en los que se explican los efectos que producen diferentes factores analizados sobre maíz tales como: el tipo de fertilizante aplicado durante la siembra, la densidad de siembra utilizada, la tecnología genética de la semilla, la marca comercial del maíz y la topografía del terreno. En este sentido, esta tesis aporta nuevos conocimientos sobre este cereal, el cual es uno de los pilares económicos de Argentina en términos de producción nacional de granos.

ABSTRACT

Sample preparation is a decisive stage in the analytical procedure. Maize grains have a complex organic matrix, due to its high starch, fat and fiber content, so it requires mineralization by microwave oven before introduction to MP-AES. This thesis proposes a quick and simple sample treatment, as an alternative to conventional sample pretreatment, by means of mineralization of dry and ground grains with HNO3 and subsequent heating using ultrasound, accelerating analysis times and improving performance and productivity.

On the other hand, the multielemental composition can be an important indicator of the quality of crops in relation to physiological stress factors, as well as for human health, being significant in biological systems and in the final quality of a product. The multielemental analysis in MPAES of samples of maize grains and leaves was carried out and the analytical data were analyzed by chemometric, in which the existence of groups of samples that presented similar responses according to the concentration of the elements analysed, was evaluated. Several classification models were obtained, in which the effects produced by different factors in maize were analyzed and explained, such as: the type of fertilizer applied during sowing, sowing density, genetic technology of seeds, commercial brands of maize and topography. In this way, this thesis provides new knowledge about this cereal, which is one of the economic pillars of Argentina in terms of national grain production.

PREFACIO

En términos de producción agrícola, la región pampeana y en especial, la provincia de La Pampa participa de manera significativa en la producción nacional de granos, destacándose soja, maíz, girasol, sorgo, centeno, avena, trigo.

El análisis elemental de cultivos se encuadra dentro del área de investigación conocida como elementómica, concepto recientemente introducido, de gran actualidad y creciente desarrollo, que estudia la cuantificación y distribución de elementos en sistemas biológicos. La combinación del análisis elemental y la quimiometría, pretende obtener modelos clasificatorios multivariados de los cultivos basados en aspectos geográficos, ambientales, antropogénicos, biológicos, entre otros, lo cual puede ofrecer información de interés tal como calidad nutricional de semillas, áreas de mayor susceptibilidad climática o antropogénica. Esto es importante para el sector agrícola pampeano, ya que no existen antecedentes en el tema hasta la fecha.

El estudio elementómico requiere del desarrollo de diferentes metodologías analíticas, por lo que es necesario contar con técnicas modernas, sensibles y selectivas por los bajos niveles de concentración y la complejidad de las matrices en las que muchas veces se encuentran las distintas especies elementales. En este sentido, la espectroscopía de emisión atómica por plasma microondas (MP-AES) es uno de los métodos analíticos más versátiles disponibles en la actualidad. Sus principales ventajas están relacionadas a la detección multielemental simultánea, elevada sensibilidad, amplio intervalo de linealidad de respuesta, bajo nivel de interferencias en comparación a otros métodos, permitiendo la detección de un gran número de elementos.

Los perfiles elementales de las muestras de cultivos pueden ser analizados mediante el uso de técnicas de análisis multivariadas no supervisadas tales como Análisis de Componentes Principales (PCA) y el Análisis de Agrupamientos o Clusters (CA) entre otras. Dentro de estas, los datos son tratados en forma independiente, en general este tipo de técnicas permite realizar análisis de tipo exploratorio y dan información sobre la estructura oculta en la que se encuentran dispuestos los datos. Sumado a ello, también son sumamente útiles para seleccionar las variables de mayor peso en el sistema clasificatorio. Por otra parte, otras técnicas de análisis multivariados supervisados, tales como el Análisis Discriminante Lineal (LDA), permiten obtener modelos de calibración o entrenamiento, en donde se agrupan las muestras según un determinado criterio clasificatorio, para posteriormente predecir otro grupo de muestras, conocidas como grupo de validación, que permitan evaluar estadísticamente los diferentes grupos definidos empleando muestras conocidas. El modelo matemático así creado se utiliza luego para predecir la correspondencia de nuevas muestras desconocidas a un determinado grupo o clase y permitir una determinada clasificación.

En este trabajo se han analizado por MPAES muestras de granos de maíz, para las cuales previamente se ha desarrollado un pretratamiento de muestras, que permitió la correcta introducción al sistema. Las concentraciones elementales presentes en las muestras de maíz son una fuente de información que puede ser utilizada para propósitos de clasificación.

El estado eco-fisiológico esperado de las plantas para una producción de maíz más adecuada y eficiente es fundamental para tomar decisiones sobre las prácticas de cultivo para lograr rendimientos altos. Por esta razón, una mejor comprensión de los efectos del manejo de cultivos sobre el perfil mineral de las semillas contribuye a una mejor expresión del potencial de los cultivos mediante el ajuste adecuado de las prácticas agronómicas individuales.

La combinación de análisis elemental y quimiometría representa un avance tecnológico importante en la ciencia de cultivos que permite mejorar los rendimientos basados en herramientas estadísticas sin pérdida de gastos en el tratamiento de suelos o plantas.

CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN

El maíz

1.1.1. El maíz en la historia

El maíz es un cereal nativo de América, cuyo centro original de domesticación fue Mesoamérica, desde donde se difundió hacia todo el continente [1]. No hay un acuerdo sobre cuándo se empezó a cultivar el maíz, pero los indígenas mexicanos afirman que esta planta representa diez mil años de cultura. El nombre “maíz”, con que se lo conoce en el mundo de habla española, proviene de mahís, una palabra del idioma taíno, que hablaban pueblos indígenas de Cuba, donde los europeos tuvieron su primer encuentro con este cultivo. En maya el nombre de este cereal es xim o xiim y es posible que la agricultura tanto en esta civilización como en Mesoamérica se haya originado con la domesticación del maíz. La nación Maya nació en las zonas altas de Guatemala y se extendió al bosque húmedo tropical. El maíz, que es el cultivo símbolo de este pueblo, ha sido el elemento central de su agricultura. Los mayas consideraban que el maíz fue una dádiva de los Dioses a los hombres, y que cultivarlo y cuidarlo era un deber sagrado. Algunas características del sistema agrícola maya fueron: agricultura itinerante, sistema de ordenación de bosques, rotación de cultivos y descanso del suelo, tala selectiva de árboles útiles basándose en el conocimiento de la fenología de las especies y mejoramiento genético del maíz [2].

En Sudamérica, la región andina es uno de los centros de origen de la agricultura. Diversas sociedades andinas crearon los sistemas productivos, adaptados a distintos pisos ecológicos y domesticaron una gran cantidad de cultivos que fueron la base de su dieta. Aunque en Sudamérica originalmente no se lo cultivó, el maíz fue introducido tempranamente en el mundo andino y desde entonces ha sido mejorado intensamente.

Si bien el desarrollo de la agricultura en Sudamérica fue posterior, el maíz constituyó un elemento importante para la aceptación y práctica de la misma. A partir de la cultura Valdivia, el cultivo del maíz se extendió a lo largo de la costa del Pacifico. En Perú los ocupantes de las zonas próximas a manantiales costeros habían empezado a plantar y cosechar el maíz por lo menos desde 200 años a.C. y posiblemente tan temprano como 1000 a.C.

La cultura Inca se basó en el conocimiento de los ecosistemas de altura, lo que les permitió el manejo de distintas ecorregiones, pisos térmicos y de diversas subregiones de humedad. Su tecnología agrícola tuvo las siguientes características: un muy desarrollado sistema de riego mediante un complicado sistema de terrazas y acequias, domesticación y mejoramiento de especies vegetales, rotación de cultivos, uso de cultivos asociados para protección fitosanitaria, uso de fertilizantes orgánicos y uso de herramientas adecuadas para la conservación de suelos. Los Incas tenían además un profundo conocimiento meteorológico y astronómico, que era utilizado para realizar predicciones del clima, fijar fechas de siembra y cosecha.

Por su parte, los guaraníes es otra cultura antigua que dio origen a las prácticas agrícolas en Sudamérica. Estas prácticas se originaron en zonas selváticas, donde es muy difícil obtener alimentos, debido a que los recursos se hallan muy dispersos.

Una agricultura con el sistema de tala y roza se desarrolló también en la cuenca amazónica, siendo el maíz un cultivo importante durante ese período. Hacia el sur del continente, alrededor de 500 años d.C. se establecieron en la zona de los lagos precordilleranos del valle central de Chile los grupos considerados como antecesores de los Mapuche; éstos formaron grupos reducidos que basaban su supervivencia en la caza, la recolección y la agricultura en pequeños huertos ubicados en terrenos húmedos. Los ambientes en los que se desenvolvió la cultura Mapuche permitieron el desarrollo de una agricultura en pequeña escala con cultivos de maíz, papa, quinua, calabaza y ají entre otros.

La palabra maíz, como se mencionó anteriormente, es de origen indígena caribeño y significa literalmente “lo que sustenta la vida” [3]; es uno de los cuatro cultivos de cereales de mayor producción mundial -trigo, arroz, maíz y cebada- muy cultivado en los países en vía de desarrollo y constituye un recurso fundamental en alimentación de la población, además de ser ampliamente utilizado en la elaboración de concentrados para animales monogástricos, especialmente para cerdos y aves. La forma de utilización más frecuente es el grano, no obstante, el forraje se utiliza en varias etapas de crecimiento de la planta en pastoreo o ensilado, especialmente en la alimentación de vacas lecheras de alta producción y en sistemas intensivos de ganadería.

Como ya se ha descripto, el maíz ha sido el principal cultivo de las culturas antiguas y hoy en día continúa como un importante componente de la dieta básica de muchos países del mundo; ha pasado por un proceso de selección y mejora, lo que ha generado muchas variedades y debido a su gran diversidad genética, hoy no tiene la misma composición química que en el pasado.

Por su productividad y adaptabilidad, el cultivo de maíz se ha extendido rápidamente a lo largo de todo el planeta después de que los españoles y otros europeos exportaran la planta desde América durante los siglos XVI y XVII.

1.1.2. El Maíz en Argentina

La agricultura argentina es una de las principales actividades económicas del país, ya que no solo abastece a la población, si no que el excedente se destina a la exportación. Argentina tiene una superficie continental de alrededor de 2,8 millones de kilómetros cuadrados y cuenta con aproximadamente 34 millones de hectáreas con cultivos agrícolas. Los principales cultivos que ocupan esa superficie son: soja, trigo, maíz, girasol, sorgo y arroz. El volumen total de producción de cereales y oleaginosas fue 97,5 millones de toneladas en la campaña 2015/2016, destacándose fundamentalmente por el elevado valor económico por unidad de peso y por la alta producción por unidad de superficie cultivada [4].

El maíz se cultiva principalmente en el norte y sureste de la Provincia de Buenos Aires, sur de Santa Fe, sur de Córdoba y norte de La Pampa. En el mapa de la figura 1.1 se muestran las zonas del país en donde predomina el cultivo de maíz.

En los últimos años, la producción de maíz tuvo un aumento sostenido que pasó de 23,7 millones de toneladas producidas en la temporada 2010/2011, a 25 millones para la temporada 2012/2013 y 29,8 millones de toneladas en 2013/2014. Según el Departamento de Estimaciones Agrícolas de la Bolsa de Cereales [5], la cosecha de maíz de la campaña 2014/2015, fue de 30 millones de toneladas con 3,85 millones de hectáreas sembradas.

El análisis de la Guía Estratégica para el Agro de la Bolsa de Comercio de Rosario para la campaña 2016/2017, calculó la siembra de 5,8 millones de hectáreas, proyectando una producción de 38 millones de toneladas de maíz, lo que superaría a la campaña 2015/2016 en 8 millones y con superficie sembrada de 4,9 millones de hectáreas [5].

Figura 1.1 Localización de las áreas productoras de maíz en Argentina [5].

La tabla 1.1 muestra los datos actualizados por la bolsa de cereales de Rosario para las últimas dos campañas de maíz en Argentina [5].

Tabla 1.1: Datos de actualizados por la Bolsa de Comercio de Rosario para las campañas de maíz en los últimos años.

CAMPAÑA

ÁREA SEMBRADA

RINDE

PRODUCCIÓN

(millones ha)

(QQ/Ha)

(millones Tn)

2016/17

5.8

79.2

38

2017/18

6.43

59.8

32.04

2018/19

7

82.4

51

2019/20

7.2

86.2

51.5

Durante las últimas décadas, el cultivo de maíz ha presentado un incremento continuo en productividad, como resultado de un conjunto de prácticas de manejo implementadas, junto con el progreso del mejoramiento genético. Este incremento en productividad trae aparejado un aumento de la materia seca total y, en consecuencia, de la acumulación o absorción de nutrientes [6].

1.1.3. La Planta de Maíz

1.1.3.1. Morfología

El maíz se clasifica dentro del género Zea perteneciente a la familia Gramínea o Poaceae, que incluye también importantes cultivos agrícolas como el trigo, arroz, avena, sorgo, cebada y caña de azúcar [7]. La clasificación botánica de este cultivo es la siguiente:

Reino: Vegetal

Subreino: Embriobionta

División: Angiospermae

Clase: Monocotyledoneae

Orden: Poales

Familia: Poaceae

Género: Zea

Especie: Mays

Nombre científico: Zea mays L.

Independientemente de la variedad, las plantas de maíz tienen las mismas partes básicas y estructura de la planta (figura 1.2):

Raíz: el sistema radicular de la planta de maíz presenta tres tipos de raíces: las raíces primarias son emitidas por la semilla, suministran el anclaje y los nutrientes a la planta; tienen una duración de dos a tres semanas; se reconocen inicialmente por mostrar un grupo de una a cuatro raíces. Las raíces adventicias se originan de los nudos que se encuentran debajo de la superficie del suelo y pueden alcanzar hasta 2 m de profundidad; éstas constituyen casi la totalidad del sistema radicular. Por su parte, las raíces de sostén surgen de los nudos cerca de la superficie del suelo, son las que proporcionan estabilidad a la planta, tienen la capacidad de realizar fotosíntesis y de absorber fácilmente el fósforo.

Tallo: además de cumplir la función de soporte, transporta sales minerales y agua desde la raíz hasta la parte aérea de la planta. Está compuesto por una epidermis exterior protectora, impermeable y transparente, una pared de haces vasculares por donde circulan los nutrientes y una médula de tejido esponjoso y blanco donde almacena reservas alimenticias, en especial azúcares. El tallo puede funcionar como órgano de almacenamiento de nutrientes, especialmente sacarosa, la cual ayuda al llenado del grano.

Hoja: la planta posee entre 15 y 30 hojas que crecen en la parte superior de los nudos, abrazando el tallo mediante estructuras llamadas vainas. La cara superior de la hoja es pilosa, adaptada para la absorción de energía solar, mientras que la cara inferior tiene estomas que permiten el proceso de respiración. En la superficie foliar, justo en la unión del limbo con la vaina, existe una proyección delgada y semitransparente que envuelve el tallo llamada lígula, su función es restringir la entrada de agua y reducir las pérdidas por evaporación.

Flores: el maíz es una planta monoica, es decir, presenta flores masculinas y femeninas. Las flores masculinas se agrupan en una panícula terminal llamada espiga, y las femeninas se reúnen en varias panojas o mazorcas que nacen de las axilas de las hojas del tercio medio de la planta. Si la mazorca o inflorescencia femenina es fecundada, dará lugar a los granos, más o menos duros, de color amarillo, rojizo o blanco. Toda la inflorescencia femenina está protegida por las brácteas que tienen como función la protección del grano. Cada planta puede tener entre una a tres mazorcas dependiendo de la variedad, la población y las condiciones climáticas.

Grano: es el fruto de la planta, compuesto por una cariópside que consta de tres partes principales: la pared, el endospermo y el embrión. La cubierta o capa de la semilla se llama pericarpio, es dura y debajo de ella se encuentra la capa de aleurona, que le da el color al grano y que contiene las proteínas.

Figura 1.2 Partes que componen a la planta de maíz [3].

1.1.3.2. Factores edafoclimáticos que afectan el maíz

El maíz es una planta que tiene una gran capacidad de respuesta a las oportunidades que ofrece el medio ambiente, y tiene alto nivel de respuesta a los efectos de la luz. 

Actualmente, existe una gran diversidad de variedades útiles para su cultivo bajo condiciones naturales muy distintas de las propias de su hábitat original. Se adapta a una amplia variedad de suelos donde puede producir buenas cosechas, si se emplean los cultivares adecuados y técnicas de cultivo apropiadas. En general, los suelos más aptos para el cultivo del maíz son los de textura media (francos), fértiles, bien drenados, profundos y con elevada capacidad de retención para el agua. El maíz, en general, crece bien en suelos con pH entre 5,5 y 7,8. Fuera de estos límites suele aumentar o disminuir la disponibilidad de ciertos elementos y se produce toxicidad o carencia. Cuando el pH es inferior a 5,5 a menudo hay problemas de toxicidad por la presencia de aluminio y manganeso, además de carencia de fósforo y magnesio; con un pH superior a 8 tiende a presentarse carencia de hierro, manganeso y zinc.

La falta de agua es el factor más limitante en la producción de maíz. Cuando hay estrés hídrico o sequía durante las primeras etapas (15 a 30 días) de establecido el cultivo, pueden ocasionarse pérdidas de plantas jóvenes, reduciendo así la densidad poblacional o bien estancar su crecimiento. Sin embargo, el cultivo puede recuperarse sin afectar seriamente el rendimiento. Cerca de la floración, el maíz es muy sensible al estrés hídrico y el rendimiento de grano puede verse seriamente afectado si se produce sequía durante este período. En general, el maíz necesita por lo menos de 500 a 700 mm de precipitación bien distribuida durante el ciclo del cultivo. El maíz es muy sensible también al aniego o encharcamiento; desde la siembra hasta aproximadamente los 15-20 días, el aniego por más de 24 horas puede dañar el cultivo especialmente si las temperaturas son altas, porque el meristemo está debajo de la superficie del suelo en esos momentos. Más tarde, en el ciclo de cultivo, el aniego puede ser tolerado durante períodos de hasta una semana, pero se reduce considerablemente el rendimiento.

Si bien el maíz se adapta muy bien a todo tipo de suelo [8], un adecuado manejo de éste es clave para la sustentabilidad de la producción agrícola, ya que sus características determinan en mayor o menor medida el tipo de explotación que puede ser realizada y también porque, a largo plazo, este recurso será alterado positiva o negativamente por dicha práctica. Sin embargo, la naturaleza compleja y variable de los procesos que tienen lugar en el suelo dificultan la predicción de sus condiciones; por esta razón las tecnologías del cultivo deben desarrollarse a partir del conocimiento de la respuesta a los niveles de fertilidad y de la capacidad de los suelos para entregar agua, entre otros factores [9].

Las condiciones fisicoquímicas de los suelos modulan la disponibilidad de nutrientes durante el ciclo del cultivo y afectan a los procesos que regulan el crecimiento, la generación del rendimiento y la calidad de los granos.  Debido a la influencia directa que estos nutrientes tienen sobre los procesos fisiológicos y bioquímicos de las plantas, es prudente establecer una relación entre la nutrición del cultivo y las variables vinculadas con la generación de rendimiento. 

1.1.3.3. Variedades de maíz

Todos los maíces pertenecen a la misma especie y los tipos o razas que los diferencian corresponden a una clasificación utilitaria y no botánica.  Los distintos tipos de maíz presentan una multiplicidad de formas, tamaños, colores, texturas y adaptación a diferentes ambientes, constituyendo numerosas variedades que son cultivadas actualmente [10]. Los maíces más importantes en términos económicos son:

Tipos duros o Flint: la raza representativa es cristalino colorado, e incluye al maíz plata, requerido principalmente por la industria de molienda seca. Tradicionalmente se utilizaba para la obtención de polenta, pero sus usos se han multiplicado progresivamente, se lo emplea para la fabricación de cereales para desayuno o como alimento para animales.

Tipos dentados: entre los maíces nativos se destaca el Dentado Amarillo. Estos tipos de maíces son muy utilizados por la industria de molienda húmeda para la obtención de alcohol, almidones y fructosa, entre otros ingredientes empleados en la industria alimentaria.

Tipos reventadores o Pisingallo: corresponden a los maíces cuyo endospermo es vítreo, muy duro. En contacto con el calor, el endospermo se expande formando la "palomita" de maíz.

Tipos harinosos: el endospermo de estos maíces es casi enteramente harinoso. Son muy utilizados para su consumo fresco (choclo) y en la elaboración de diversas comidas tradicionales basadas en harina de maíz.

1.1.3.4. Composición química y valor nutritivo del maíz

Existe un número de datos importantes sobre la composición química del maíz y muchos estudios han sido llevados a cabo para tratar de comprender y evaluar las repercusiones de la estructura genética sobre la gran cantidad de variedades de maíz que existen, así como la influencia de factores ambientales y prácticas agronómicas en los elementos químicos constitutivos y en el valor nutritivo del grano y sus partes anatómicas. La composición química del grano que se utiliza luego para consumo es un aspecto importante del valor nutritivo, en el que influyen diversos aspectos como la estructura física del grano, factores genéticos y ambientales.

Figura 1.3 Estructura del grano de maiz [3].

Las principales partes del grano de maíz (figura 1.3) difieren considerablemente en su composición química. El pericarpio se caracteriza por un alto contenido de fibra cruda, aproximadamente el 87%, formada fundamentalmente por hemicelulosa (67%), celulosa (23%) y lignina (0,1%). El endospermo, en cambio, contiene un alto nivel de almidón (87%), aproximadamente 8% de proteínas y un contenido de grasas crudas relativamente bajo. El germen se caracteriza por un gran contenido de grasas crudas, el 33%, y contiene también una gran cantidad de proteínas (aproximadamente 20%) y minerales. El contenido de hidratos de carbono y proteínas de los granos de maíz depende del endospermo, así como del contenido de grasas crudas y en menor medida, de proteínas y minerales del germen. La fibra cruda del grano se encuentra fundamentalmente en el pericarpio.

La información disponible sobre la composición química del maíz permite conocer que la variabilidad de cada uno de sus principales nutrientes es muy amplia. Esta variabilidad es afectada tanto por aspectos genéticos como ambientales y puede influir en la composición química del endospermo, el germen y la cáscara de los granos. El componente químico principal del grano de maíz es el almidón, al que corresponde hasta el 72-73 % del peso del grano [11]. Las proteínas constituyen el siguiente componente en orden de importancia: en las variedades comunes, el contenido de proteínas puede oscilar entre el 8 y el 11% del peso del grano, y su mayor contenido se encuentra en el endospermo [12].

El aceite del grano de maíz está fundamentalmente en el germen con valores que van del 3 al 18%, tiene un bajo nivel de ácidos grasos saturados: ácido palmítico y esteárico, con valores medios del 11% y el 2%, respectivamente. En cambio, contiene niveles elevados de ácidos grasos poliinsaturados, fundamentalmente ácido linoleico (24%). Este aceite es relativamente estable ya que contiene pequeñas cantidades de ácido linolénico (0,7%) y niveles elevados de antioxidantes naturales. Además, presenta cantidades elevadas de fibra dietaria [3].

1.1.3.5. Composición mineral del maíz

Los minerales esenciales para las plantas son aquellos necesarios para la ocurrencia de un ciclo de vida completo, involucrados en funciones metabólicas o estructurales en las cuales no pueden ser sustituidos y cuya deficiencia se asocia a síntomas específicos. Los minerales esenciales incluyen: C, H, O, N y S (principales constituyentes de la materia orgánica), P, B y Si (esterificados con alcoholes en las plantas), K, Na, Mg, Ca, Mn y Cl (absorbidos como iones de la solución del suelo), y Fe, Cu, Zn y Mo (absorbidos como iones o quelatos). La adición más reciente al grupo de minerales esenciales es el Ni, involucrado en el metabolismo de la urea y de los ureidos, así como en la absorción de Fe, en la viabilidad de las semillas, en la fijación de N y en el crecimiento reproductivo.

La concentración de cenizas en el grano de maíz es aproximadamente del 1,3%, dependiendo principalmente de factores ambientales, el cual representa el contenido mineral total del grano. El germen es relativamente rico en minerales, con un valor medio del 11%, frente a menos del 1% en el endospermo. El germen proporciona cerca del 78 % de todos los minerales del grano. El mineral que más abunda es el fósforo, en forma de fitato de potasio y magnesio, encontrándose en su totalidad en el embrión con valores de aproximadamente 0,9%. Al igual que en la mayoría de los granos de cereal, el maíz contiene un bajo contenido de Ca y de oligoelementos.

1.2. Técnicas Espectrometricas para el Análisis Multielemental

1.2.1. Introducción a los Métodos Espectroscópicos

La espectroscopía constituye la base del análisis espectroquímico, donde la interacción de la radiación electromagnética con la materia es utilizada para obtener información cualitativa y cuantitativa acerca de la composición de una muestra [13][14]. La espectroscopía atómica implica la interacción entre la radiación electromagnética con átomos al estado gaseoso, ya sea absorción, emisión o fluorescencia atómica. Estos fenómenos están asociados con cambios en los estados de energía de las diferentes especies.

Por consiguiente, dado que cada especie posee estados energéticos característicos, la espectroscopía puede utilizarse para identificar y cuantificar la composición elemental de la muestra a analizar [15]. En los últimos cincuenta años, los métodos espectroscópicos han evolucionado junto con el avance tecnológico, lo que ha permitido un gran salto en la química analítica, alcanzando límites de detección de μg a pg por litro.

La espectroscopía de emisión atómica es una de las técnicas espectroscópicas más antiguas; ya desde 1925 la espectrometría de emisión atómica fotográfica (espectrografía) fue aceptada como una técnica analítica cuantitativa multielemental. En los años 1960s, la técnica de emisión atómica fue perdiendo interés, y reemplazada en gran medida por la espectroscopía de absorción atómica.

Sin embargo, en los años 1970s y con el advenimiento de nuevas fuentes de emisión tales como el plasma acoplado inductivamente- se observó un resurgimiento del interés en las técnicas de emisión atómica, acompañado todo esto por el mejoramiento de los sistemas de detección. El desarrollo del plasma acoplado inductivamente (ICP) en el análisis por espectroscopía de emisión atómica constituyó un avance importante en esta área.

1.2.2. Espectroscopía de Emisión Atómica

El análisis por espectroscopía de emisión atómica está basado en el siguiente principio: “los átomos y iones excitados emiten radiación de una longitud de onda característica cuando los electrones externos retornan a los orbitales de menor energía”. Cada elemento tiene una configuración electrónica diferente y, consecuentemente su espectro de emisión es único.

En la medida que el número de electrones asociado con un núcleo atómico particular aumenta, se ve también incrementado el número de transiciones electrónicas posibles y, por lo tanto, el número de líneas de emisión de diferentes longitudes de onda.

Bajo condiciones bien controladas, la intensidad de una línea particular es proporcional al número de átomos que están siendo excitados. Por lo tanto, el analista puede usar la espectroscopía de emisión tanto para identificar los diferentes elementos presentes en una muestra (análisis cualitativo) como también para calcular su concentración (análisis cuantitativo). El número de líneas de emisión para un elemento particular está relacionado con el número de electrones que rodean al núcleo atómico. Sin embargo, el número de líneas de emisión producidas depende de la temperatura de la fuente de excitación empleada.

El fundamento de la Espectroscopía de Emisión Atómica (AES) se basa en la absorción de energía de un átomo que se encuentra en su menor estado energético, denominado estado fundamental, al cual se le transfiere energía calórica del atomizador (plasma o llama), suministrando energía suficiente para promover uno de los electrones ubicado en un orbital externo, a un estado electrónico de mayor energía, estado excitado. Al retornar al estado fundamental, este emite el exceso de energía bajo la forma de fotón (radiación característica) produciendo así una señal de emisión atómica. La energía del fotón será igual a la diferencia de energía entre los estados fundamental y excitado y este proceso es conocido como transición electrónica [14].

1.2.3. Espectrometría de Emisión Atómica con Plasma Inducido por Microondas (MPAES)

La espectroscopía de emisión atómica suele llamarse a menudo espectroscopía de emisión óptica, debido a la naturaleza de la luz que se emite. Es por eso por lo que suelen utilizarse indistintamente los términos AES (espectroscopía de emisión atómica) y OES (espectroscopía de emisión óptica). Además, este último término considera las posibles emisiones no atómicas que pueden ocurrir en el plasma.

El plasma de acoplamiento inductivo ya sea de inducción por radiofrecuencia (ICP) o de inducción por microondas (siglas comúnmente utilizadas MIP o MP) es la fuente de atomización, que junto a un espectrómetro de emisión atómica u óptico (AES/OES) constituye el equipo de MPAES o ICPOES. Mediante MPAES e ICPOES es posible determinar de forma cuantitativa la mayoría de los elementos de la tabla periódica a niveles vestigio partiendo de muestras en disolución acuosa.

El proceso de emisión en MPAES se ilustra en la Figura 1.4. En forma más detallada se puede decir que la muestra, en forma líquida, es transportada por medio de una bomba peristáltica hasta el sistema nebulizador donde es convertida en aerosol por la acción del gas nitrógeno, por efecto Venturi [15][16]. Dicho aerosol es conducido a la zona de atomización. Esta zona consiste en un plasma, que es generado al someter un flujo de gas nitrógeno, y pequeñas cantidades de argón, introducidos tangencialmente a través de la antorcha, a una zona donde se aplican microondas, y se genera un campo magnético oscilante. Una chispa produce algunos electrones libres en el argón, que son acelerados en el campo magnético, causando una mayor ionización y formación del plasma, haciendo que el plasma (una vez que es generado) sea autosostenido sólo con nitrógeno. El flujo de gas que transporta la muestra genera una abertura en el plasma [13][17].

Figura 1.4. Proceso de emisión en el MPAES [16].

El plasma de nitrógeno produce una temperatura considerablemente mayor que una llama de aire-acetileno, pudiendo alcanzar temperaturas de hasta 5000 K, pero es menor a la temperatura producida por un plasma de argón, el cual alcanza 10000 K. En estas condiciones, la muestra es convertida en átomos al estado gaseoso que son excitados por consecuencia de las temperaturas que alcanza el plasma. Cada átomo de la muestra, excitado por el plasma, vuelve al estado fundamental, emitiendo radiación a una longitud de onda que es característica de cada elemento. Esta radiación pasa a través de un sistema óptico que la separa según su longitud onda. A continuación, un detector mide la intensidad de cada una de las radiaciones relacionando ésta con la concentración de cada elemento en la muestra. La información es procesada por el sistema informático [14][16][17].

MPAES se ha convertido en los últimos años en la metodología analítica de mayor interés, debido a su poder de detección, precisión, sensibilidad, velocidad, y capacidad de análisis multielemental. Además, se debe destacar los bajos costos de operación, ya que el MPAES posee un generador de nitrógeno, que utiliza el aire atmosférico para proporcionar un suministro de nitrógeno continuo que permite el funcionamiento del plasma.

1.2.3.1. Pretratamiento de muestra

Las muestras que pueden acceder a un laboratorio pueden ser de origen inorgánicas, orgánicas, biológicas, o bien una combinación de las tres. La mayoría de las veces las muestras presentan matrices muy variables y complejas, que pueden contener diversos analitos, entre ellos metales pesados y otros contaminantes.

Los procesos por los cuales los metales son liberados en las muestras dependerán primordialmente de la naturaleza de estas. Por lo tanto, es necesario trabajar con instrumentos de análisis adecuados para la determinación confiable de diferentes analitos a niveles vestigio en diferentes matrices. Los procedimientos de preparación e introducción de muestra se consideran una de las principales limitaciones de los métodos analíticos.

Existen numerosos métodos descritos en la literatura para muestras complejas, muchos utilizan separación de la matriz para evitar interferencias o, para mejorar la sensibilidad, otros utilizan procedimientos de mineralización y disolución de las muestras, como la utilización de hornos microondas, siendo en la actualidad uno de los métodos más utilizados.

El maíz presenta una matriz compleja, debido a su alto contenido en almidón, grasa, lignina, entre otros, y por este motivo es necesario desarrollar un procedimiento adecuado de pretratamiento de muestra para su introducción en MPAES.

Las muestras de origen orgánico son un desafío para los sistemas de introducción de muestras, ya que generan varios inconvenientes, como: inestabilidad en el plasma, deposición de materia orgánica e interferencias, entre otros. Generalmente se requiere la solubilización completa de la muestra, seguida de una dilución para poder ser introducida al MPAES. Sin embargo, la mineralización de la muestra puede llegar a ser un trabajo tedioso y arduo, que puede causar pérdidas de muestra (y consecuentemente de analitos) así como contaminación [18][23]. Existen pocos antecedentes en el pretratamiento de muestras de grano de maíz, que sea diferente al tratamiento convencional por horno microondas[22][26].

En una investigación destacada por el Analytical Methods Committee de la Royal Society of Chemistry [27], se indicó que la principal causa de resultados inadecuados se encuentra en la preparación de muestra, considerando que el muestreo haya sido adecuado. La preparación de muestras es una de las etapas más importantes y decisivas en el procedimiento analítico, y más aún en el contexto del análisis de elementos vestigiales, ya que es donde se comenten más cantidad de errores y donde se invierte más tiempo y dinero [18][21]. En esta etapa es posible que aumenten los errores sistemáticos y aleatorios a medida que crece el número de etapas y reactivos empleados; así como también puede disminuir la capacidad de detección de las posteriores determinaciones.

Estos tipos de errores aumentarán en la medida que disminuyan las concentraciones de analitos a determinar. De esta manera, el proceso analítico obliga a identificar y llevar a su mínima expresión cada una de las fuentes de error en el análisis [13] [15] [29]. De todos modos, es necesario tener certeza que la señal analítica obtenida en la etapa de medición es debida solamente al analito y no a la presencia de interferentes.

La posibilidad de que exista una interferencia dependerá de la eficiencia del método de separación y de la selectividad/especificidad de la etapa de medición. La selectividad y especificidad son los parámetros que avalan la confiabilidad de los resultados de las mediciones. Debido a esto, es importante recurrir a métodos donde se simplifique el tratamiento de muestras para su posterior análisis elemental, procurando alcanzar con ello la máxima selectividad y especificidad.

1.2.3.2. Calcinación

La mayoría de los métodos espectroscópicos utilizados para la determinación de metales vestigiales, requieren de la mineralización de la muestra para remover la materia orgánica, en especial si se trata de alimentos. El método más frecuentemente utilizado para la mineralización de las muestras de alimentos es la calcinación por vía seca. La calcinación vía seca se realiza en una mufla y tiene la ventaja de que no se necesitan reactivos o bien, sólo se requiere una pequeña cantidad de ellos; el rendimiento de muestras es alto y se requiere instrumental simple. Por lo general, este tratamiento representa una forma sencilla para la destrucción de la materia orgánica; la muestra es sometida durante algunas horas a temperaturas elevadas (alrededor de los 400-500°C) en presencia de oxígeno. La obtención de cenizas blancas indica la finalización de la destrucción de la matriz orgánica de la muestra, tras lo cual este residuo se debe disolver y llevar a un volumen apropiado utilizando un ácido adecuado. Los inconvenientes al emplear este tratamiento son la probabilidad de contaminación cruzada y la posibilidad de pérdida de analito por volatilización, lo que resulta un gran problema cuando se pretende analizar metales a nivel vestigio [30] [31].

1.2.3.3. Mineralización por vía húmeda

Las técnicas convencionales de mineralización por vía húmeda en vasos abiertos involucran el calentamiento de la muestra en ácido por períodos largos. Las mezclas de ácidos más comúnmente utilizados son: HNO₃/H₂O₂, HNO₃/H₂SO₄/HCIO₄ y HNO₃/HCIO₄. La vía húmeda puede utilizarse también para elementos volátiles si se seleccionan las condiciones apropiadas de oxidación.

Sin embargo, los sistemas abiertos de mineralización por vía húmeda también tienen una serie de desventajas: se requieren largos períodos de calentamiento, grandes cantidades de ácidos, existe un riesgo de contaminación y pérdidas durante la mineralización. Además, los ácidos fuertes son altamente corrosivos y el uso de ácido perclórico requiere de precauciones de seguridad especiales debido al alto riesgo de explosiones. Estas desventajas han llevado al desarrollo de sistemas cerrados donde la digestión puede realizarse bajo temperatura y presión elevadas. Esto permite que se reduzcan significativamente los tiempos de digestión y además se disminuye la utilización de grandes volúmenes de ácidos y se elimina el riesgo de pérdida de elementos volátiles o contaminación aérea.

1.2.3.4. Digestión asistida por horno microondas

La digestión asistida por microondas ha ganado aceptación y en la actualidad es ampliamente utilizada en laboratorios analíticos de todo el mundo, como método de elección para la preparación de una gran variedad de muestras complejas[32]. En 1980 las compañías empezaron a manufacturar hornos microondas industriales específicamente diseñados para laboratorios.

Estos sistemas incorporaron recubrimiento de Teflon®, cavidades de acero inoxidable con sistemas de seguridad, como puertas de varias capas con bloqueo, para un mejor ambiente de laboratorio y sistemas de control programable que hicieron posible aplicar la energía microondas de manera controlada, dependiendo de la composición química de la muestra. Así, la aplicación de la potencia del microondas se adaptó para calentar múltiples muestras de manera uniforme. Estas características de control y seguridad distinguen el sistema de microondas de laboratorio de los productos microondas para consumo en el hogar.

El siguiente avance se produjo con el uso de reactores de vaso cerrado en el microondas. Los beneficios de los vasos cerrados, como los reactores de acero de alta presión, eran bien conocidos, ya que fácilmente elevan la temperatura de reacción y proporcionan un ambiente de reacción presurizado [33].

La descomposición de muestras con ácidos en un recipiente cerrado asistido por horno de microondas permitió un rápido calentamiento y enfriamiento comparado con los reactores de acero e hizo que la preparación de muestras se convirtiera en el paso más vigoroso y rápido, brindando mayor velocidad de la técnica para la determinación Espectroscopia de Absorción Atómica (AAS) o MPAES e ICPOES.

Tradicionalmente, las muestras de laboratorio se calentaban a través de transferencia de calor por conducción térmica utilizando una fuente de calor externo (Figura 1.5). El calor es conducido dentro de la sustancia, pasando primeramente a través las paredes del vaso a fin de llegar a la muestra. El calentamiento de la muestra se realiza por la transferencia de energía de la fuente de calentamiento al contenedor y de allí a la muestra.

Por el contrario, el calentamiento por microondas se realiza directamente por el acoplamiento de la energía de microonda con las moléculas que están presentes en la mezcla de reacción. La energía se transfiere directamente a la muestra, produciendo a una rápida transferencia de energía.

El digestor de microondas se puede utilizar para mineralizar todas aquellas muestras sólidas de las cuales se quiera obtener información a nivel elemental mediante técnicas espectroscópicas, las cuales en la mayoría de los casos requieren que la muestra esté en estado líquido.

La muestra es calentada en los vasos cerrados transparentes a las microondas junto con los ácidos recomendados, a una temperatura máxima de trabajo que normalmente se encuentra entre 180-220ºC dependiendo del tipo de muestra: a esta temperatura se produce la degradación parcial o total de la muestra.

Las soluciones químicas involucradas en una digestión por microondas son altamente polares y excepcionalmente iónicas, proporcionando ambos tipos de mecanismos de calentamiento por microondas. En un sistema de digestión por microondas bien distribuido, la energía microondas se transfiere a la mayoría de las especies altamente absorbentes en el sistema, que son usualmente la muestra y el ácido de extracción. El sobrecalentamiento de los componentes de la reacción es esencial para el proceso cinético de mineralización de la muestra. 

Los reactivos más utilizados para la mineralización son: ácido nítrico, ácido clorhídrico y agua oxigenada. Aunque la elección del ácido depende del origen de la muestra. Pueden utilizarse solos o como mezclas: agua regia (HNO₃/HCl) en relación 1:3 (para metales, aleaciones, aceros, metales preciosos), HNO₃/H₂O₂ en relación 4:1 (para muestras orgánicas, mayor poder oxidante), HNO₃/HCl en relación 4:1 (para atacar parcialmente los silicatos en muestras inorgánicas). El resultado tras la digestión es una disolución acuosa ácida, adecuada para su posterior análisis mediante técnicas espectroscópicas.

Figura 1.5 Esquema de calentamiento convencional (izquierda) y por microondas(derecha) para una muestra.

En la actualidad, la digestión por microondas es uno de los procedimientos estándar en la preparación de muestras para el análisis elemental en química analítica. Esta técnica es mucho más eficiente que la digestión vía húmeda convencional y ha sustituido a las técnicas clásicas de mineralización. La gran ventaja de la digestión con horno microondas frente a la digestión convencional es la posibilidad de controlar de forma precisa parámetros como la presión o la temperatura, o la posibilidad de digerir la muestra en tiempos muy reducidos, ya que la velocidad de calentamiento dentro del horno es muy alta [34].

1.2.3.5. Digestión asistida por ultrasonido.

Los ultrasonidos se propagan a través de una serie de ondas de compresión/expansión que viajan a través de un medio. Los ciclos de compresión unen las moléculas del medio mientras que los ciclos de expansión las separan. En un medio líquido, el ciclo de expansión de los ultrasonidos genera la suficiente presión negativa cómo para romper las fuerzas de cohesión de las moléculas del líquido, separándolas localmente, creando una microcavidad o burbuja.

Como se puede observar en la figura 1.6, las burbujas van creciendo a medida que aumentan los ciclos, atrapando vapores y gases del medio. Esta implosión de la cavidad crea un entorno inusual para las reacciones químicas. La rápida compresión de los gases y vapores dentro de la burbuja genera altas temperaturas y presiones (de hasta 5000ºC y 1000 atm). Dado que las burbujas son muy pequeñas en comparación con el volumen del líquido que las rodean, el calor generado se disipa rápidamente, con lo cual las condiciones ambientales se mantienen inalteradas. Esta combinación de altas temperaturas, altas presiones y rápido enfriamiento genera unas condiciones difícilmente alcanzables con otras técnicas [36].

Figura 1.6 Ciclos de expansión/compresión de una burbuja producida en el seno de un líquido por ultrasonido [35]

El uso de ultrasonido es una tendencia creciente en áreas científicas como la medicina y la tecnología industrial. En los últimos años, la utilización de ultrasonido ha tenido mayor impacto en la química analítica, contemplando los usos más básicos como por ejemplo la limpieza del material de laboratorio, hasta su utilización en la participación de preparación de muestra. Estos dispositivos han sido capaces de ayudar a perfeccionar, acelerar o automatizar la preparación de muestra, como así también, mejorar la detección de los analitos [37].

El baño ultrasónico es la fuente más ampliamente disponible, comúnmente utilizada y más económica para introducir ultrasonidos en una reacción. Posee un transductor, componente electromecánico encargado de generar el ultrasonido, que está fijo en la base de un baño de acero lleno de agua. Los baños de ultrasonidos trabajan con frecuencias entre 30 y 50 kHz [37]. En preparación de muestra, los baños ultrasónicos implican la inmersión de una batería de tubos tipo Falcon, que contienen la muestra con la mezcla de reactivos; aplicando una distribución uniforme de energía ultrasónica en el medio de reacción que permite la digestión de la muestra a analizar.

1.3. Introducción a la Clasificación Quimiométrica

1.3.1. Generalidades

En el campo de la química, tanto la automatización como la computarización de los laboratorios, ha generado como consecuencia, la rápida adquisición de gran cantidad de datos, los cuales deben poder ser interpretados y procesados en un contexto adecuado para convertirlos en información útil para el usuario [38].

La Quimiometría es la disciplina que tiene esta finalidad. En cierta forma, la palabra quimiometría resume el concepto que engloba la medida en química.

Luc Massart, uno de los fundadores de la Quimiometría, la definió como: La disciplina química que utiliza la matemática, la estadística y la lógica formal para diseñar o seleccionar procedimientos experimentales óptimos; proporcionar la máxima información química relevante a partir del análisis de datos químicos y obtener conocimiento de sistemas químicos [39].

El amplio espectro de herramientas quimiométricas involucra el uso de técnicas estadísticas tanto univariadas como multivariadas. En este contexto, el uso de herramientas multivariadas reportado en sistemas agrícolas es muy amplio y diverso, lo cual ofrece una importante idea de que estas herramientas son factibles de utilizarse con éxito en muestras vegetales a los fines de obtener modelos clasificatorios multivariados de interés científico y agropecuario. Así, por ejemplo, existen trabajos previos referidos al estudio clasificatorio de diversas muestras basadas en su composición química, para reconocer origen geográfico, variedades, calidad, etc [38][40].

Estas publicaciones han determinado el origen geográfico o botánico de mieles [40][42], vinos [43], análisis de aceites comestibles[44][47], cultivos [48] [49] y variedades de frutas[50], entre otros. Debido a esto, el uso de herramientas multivariadas aplicadas al estudio de clasificación resulta de gran importancia debido a las múltiples posibilidades de análisis que brinda. Dichas posibilidades tienen gran impacto en la clasificación de muestras agroalimentarias, desde materias primas hasta productos elaborados, ya que permiten el control de calidad de estos, así como la autenticación de muestras y detección de posibles fraudes.

Los primeros estudios relacionados al análisis multivariado aplicado a datos químicos fueron realizados por Bruce Kowalsky y Svanden Wold en la década del ’80. Desde ese momento, el desarrollo de nuevas metodologías multivariadas ha crecido notablemente, sobre todo a partir de 1990 con el desarrollo de nuevas tecnologías en programación y sistemas de computación. Actualmente, estan surgiendo nuevos trabajos referidos a análisis multivariado para diferentes tipos de muestras y analitos de interés. El empleo de herramientas multivariadas no se limita sólo al análisis químico, sino también se extiende a otras áreas tales como la economía (econometría), biología (biometría), psicología (psicometría), sociología (sociometría) y diseño de fármacos (QSAR) [51].

Las herramientas de clasificación multivariada constituyen una serie de algoritmos matemáticos aplicados para la clasificación de grupos de muestras basados en las similitudes de las propiedades medidas (variables). Dichas variables pueden estar constituidas por la concentración de diferentes especies químicas (orgánicas e inorgánicas), así como por datos espectrales o cromatográficos procedentes de un gran número de técnicas analíticas [52].

La clasificación multivariada puede ser usada para el desarrollo de un modelo matemático con el objeto de poder hallar eventuales propiedades de interés en los grupos de muestras o propiedades ocultas: la manifestación de estas propiedades puede dar lugar a algún tipo de clasificación de interés. También se aplica para la determinación de fenómenos desconocidos de un grupo de muestras, interpretación de procesos, etc.

Tanto sea el número de propiedades de interés como el número de variables iniciales óptimas, deben ser determinadas en forma meticulosa, ya que cuando el modelo obtenido es demasiado simple (es decir, con subajuste) se ven introducidos errores sistemáticos, o bien cuando el modelo es muy complejo (es decir, sobreajustado) se pueden obtener errores aleatorios significativos [38][53].

Las herramientas de clasificación se dividen en dos grupos:

Métodos no supervisados: El objetivo de esta clase de métodos es encontrar o identificar tendencias de muestras a agruparse en subgrupos sin utilizar ningún tipo de información previa. Este es un tipo de análisis que es a menudo muy útil en una etapa temprana de una investigación para explorar, por ejemplo, si puede haber muestras de diferentes subgrupos en el conjunto de datos, basados en las diferentes propiedades de estas. Así, resultan muy importantes para ser utilizadas como criterio de selección de variables. Dentro de los métodos no supervisados están incluidos, entre otros, el Análisis de componentes principales (PCA) y el Análisis de agrupamientos (CA).

Métodos supervisados:estos métodos se utilizanpara predecir a qué clase pertenecen las muestras desconocidas. Por ello, son utilizados principalmente para construir reglas de clasificación para un número de subgrupos especificados previamente. Estas reglas se utilizan después para la asignación de clases en nuevas muestras. Los modelos obtenidos pueden evaluarse utilizando de manera separada, un conjunto de calibración (para el modelado) y un conjunto de validación (para evaluar los errores del modelo), los cuales incluyen, entre otros, el análisis discriminante lineal (LDA), el análisis discriminante cuadrático (CDA) y el análisis discriminante por cuadrados mínimos parciales (PLS-DA).

De los anteriores, los más frecuentemente utilizados son PCA y CA como métodos no supervisados, en tanto LDA y PLS-DA como métodos supervisados. El PCA se utiliza para observar agrupamientos en el conjunto de muestras, a partir de sistemas predefinidos constituidos por un gran número de muestras de las cuales se conoce su composición química o alguna propiedad analítica de importancia.

La utilización de PCA permite evaluar los resultados analíticos a fin de hallar posibles propiedades ocultas, como así también la correlación entre las variables que se encuentran bajo estudio. Este aspecto resulta relevante para la posibilidad de obtener grupos de individuos (muestras) basados en la composición química o espectral de las mismas, como así también descifrar fenómenos ocultos en el conjunto de datos de las variables. El descubrimiento de estas propiedades ocultas puede permitir la discriminación de subgrupos de muestras, debiendo el analista deducir, a partir de su experiencia y conocimiento del sistema bajo estudio, cuál es esa propiedad oculta que se manifiesta. Así, en PCA, se pueden utilizar los datos de composición analítica de una serie de muestras, para luego agruparlas de manera multivariada en base a propiedades que se hallan ocultas dentro de los datos analíticos iniciales.

El análisis e interpretación por medio de PCA, involucra la confección de modelos matemáticos basados en los datos analíticos en los cuales se puede observar si existe discriminación en base a propiedades de las muestras, como así también una interpretación cualitativa de las mismas.

Una herramienta complementaria e importante a PCA es el análisis de agrupamientos o análisis de clusters (CA de su sigla en inglés Cluster Analysis), el cual es un método qué si bien no permite realizar una evaluación detallada del modelo como PCA, puede actuar como una herramienta complementaria brindando información importante. La ventaja multivariada se basa en el uso e interpretación de múltiples respuestas de manera simultánea. Por su parte, los sistemas univariados utilizan una sola señal o un solo valor de la variable independiente, lo que produce una importante pérdida de información relevante.

Por ello, la utilización de un número elevado de variables independientes permite obtener mucha más información sobre la muestra, si el conjunto de datos es tratado adecuadamente mediante el uso de herramientas multivariadas. Los métodos multivariados involucran a más de una variable independiente (p > 1), a diferencia de los univariados (p = 1). Esta diferencia abre nuevas posibilidades como por ejemplo el uso de gran cantidad de variables -químicas o espectrales- presentes en un grupo de muestras.

Sin embargo, el uso de más de una variable independiente permite la estimación de más de una propiedad dependiente (q >1) y la corrección de covarianzas indeseables (interferencias); ésta es la mayor motivación para realizar mediciones multivariadas [54].

En aplicaciones como PLS-DA, la clasificación multivariada no surge como un detallado entendimiento de la relación entre variables dependientes e independientes, pero si es necesario interpretar el modelo obtenido a fin de evaluar el tipo de clasificación obtenida y la fuente de esta. En PLS-DA, la intención del modelado es buscar una relación matemática que vincule, a través de un modelo, los datos de respuesta (matriz de variables) y de criterios de clasificación preestablecidos, surgidos a partir de un número importante de muestras de entrenamiento y de predicción. Un modelo que puede ser adecuadamente interpretado agrega valor y confianza al resultado obtenido [39].

La clasificación multivariada puede estimular el desarrollo de nuevo instrumental analítico, a través de la incorporación de adecuadas herramientas computacionales multivariadas a nuevos equipos, como así también incrementar la capacidad analítica y la precisión de los instrumentos tradicionales actuales, así como facilitar la producción de instrumental portable.

La aplicación de metodologías de clasificación multivariada al tratamiento de datos analíticos requiere que el analista conozca de los fundamentos matemáticos, como así también del sistema analítico de estudio, para que garantizar que los resultados sean adecuadamente interpretados.

1.3.2. Análisis Exploratorio de Datos

Un procedimiento de análisis de datos comienza con el análisis exploratorio de datos, en el cual se intenta resumir y visualizar los datos de la mejor manera posible. Los ejemplos típicos incluyen el uso del PCA para inspeccionar las relaciones entre las variables de los datos, así como la observación de posibles agrupaciones. Los resultados del análisis exploratorio de datos se utilizan para enfocar el análisis de datos mediante otros métodos (por ejemplo, la selección de variables relevantes para la clasificación). Los métodos de análisis de datos exploratorios son no supervisados y se componen de dos tipos [39]:

Métodos de proyección: son técnicas populares para el análisis exploratorio de los datos, ya que sus resultados generalmente son fácilmente interpretables. Las técnicas de proyección reducen la dimensionalidad de las variables originales, lo que puede resaltar la estructura en los datos (por ejemplo, grupos de muestras o variables). Los métodos de proyección ubican a las muestras en un espacio de pocas dimensiones utilizando un criterio específico (por ejemplo, la varianza acumulada en PCA). Si la agrupación de datos está relacionada con este criterio, los grupos de muestras pueden ser visualizados. La ausencia de asociaciones significativas de las muestras no significa que la información requerida no está presente.

Métodos de agrupamientos: Los métodos de agrupamiento utilizan una medida de proximidad para dividir el conjunto de datos en grupos. La agrupación tiene como objetivo dividir el conjunto de datos de n cantidad de muestras en grupos homogéneos (clusters) basados únicamente en datos cuantitativos y asignar una pertenencia a un grupo a cada una de las muestras. Entre los métodos de agrupamiento, se pueden mencionar el análisis de clusters y k-means. Debido a que se pueden usar medidas alternativas de proximidad, la agrupación se ve mejor como una herramienta de diagnóstico o exploratoria, y cualquier agrupación es mejor confirmada por métodos alternativos. Es por ello que los resultados de CA y k-means generalmente son acompañados con aquellos procedentes de PCA y PLS-DA [55][56].

1.3.3. Análisis de Componentes Principales (PCA)

El análisis de componentes principales (PCA) es un método de modelado bilineal que proporciona una visión general de la información principal contenida en una tabla multidimensional. Es también un método de proyección, porque se necesita información transportada por las variables originales, proyectándolas sobre un menor número de variables latentes conocidas como Componentes Principales (PC). Cada PC explica una determinada cantidad de la información total contenida en los datos originales y la primera PC contiene la mayor fuente de información en el conjunto de datos. Suministra una representación visual de las relaciones entre las muestras y variables y brinda información detallada sobre cómo las variables muestran similitudes, o bien en qué se diferencian.

El punto de partida para el análisis exploratorio es la matriz de los datos o respuestas (X), desde el punto de vista matemático, el procedimiento del análisis de componentes principales puede ser descripto como la descomposición de la matriz de respuestas X (I x J) en dos matrices, una de scores T y una matriz ortogonal de pesos P (loadings) de tal manera que la expresión final se representa mediante la siguiente ecuación:

X = TPT + E Ecuación 1.1.

Donde los scores expresan las relaciones entre las muestras, mientras que los loadings indican las relaciones entre las variables. Es decir que PCA implica una transformación matemática resumida de la matriz de datos original, que se puede representar por la ecuación 1 donde:

X es la matriz de datos original de dimensiones I x J donde las filas representan muestras y las columnas representan las variables y cuyos elementos representan los valores de las mediciones en las muestras (respuestas).

El número de columnas de la matriz T es igual al número de filas en la matriz P y es igual al número de componentes significativos, lo que vamos a definir por A.

T son llamados scores, tienen tantas filas como la matriz de datos original, y están representados por una matriz de dimensiones I x A.

P son llamados loadings y tienen tantas columnas como la matriz de datos original y son representados por una matriz de dimensiones A x J.

El producto TPT (donde el superíndice T indica la matriz transpuesta) puede ser considerado como un modelo de los datos que es una aproximación al conjunto de datos original, el error está representado por la matriz E.

El primer vector de los scores y el primer vector de los loadings a menudo se llaman autovectores de la primera componente principal, que se explica a través de la descomposición de valores singulares. Cada componente sucesiva se caracteriza por un par de autovectores, tanto para los scores como para los loadings.

Esta descomposición equivale a un cambio de espacio de las variables originales de dimensión J, para el espacio de las componentes principales. Cada una de las J columnas de la matriz P, define la dirección de un eje. Una vez definidos los nuevos ejes, cada muestra es proyectada y esa información se encuentra en la matriz de scores (Figura 1.7.).

Dada la posibilidad de existencia de correlación entre las variables originales, no todos los J componentes principales son necesarios para representar adecuadamente los datos, solo un subconjunto de ellos, los primeros A, los restantes contienen información irrelevante o aleatoria y están asociados al error (E). La reducción de la dimensionalidad del sistema de un espacio de dimensión J a un subespacio de dimensión A, ocurre porque las variaciones presentes en los datos fueron concentradas en un número menor de nuevos ejes, descartando las variables originales altamente correlacionadas. La figura 1.8 representa la proyección de un conjunto de muestras definidas en el espacio tridimensional, y proyectadas en un subespacio A de dos dimensiones[57].

Figura 1.7 Representación esquemática de la descomposición de la matriz X (I x J) en la matriz de scores T y la matriz ortogonal de los loadings P

Figura 1.8 Proyección de los objetos, definidos en el espacio tridimensional, en el plano formado por las dos primeras componentes principales (A=2).

1.3.3.1. Evaluación de modelos PCA

En un modelo PCA resulta de interés el estudio de relaciones entre las muestras en el espacio fila; las distancias entre las muestras son usadas para definir similitudes y diferencias. En términos matemáticos, la meta de un modelo PCA es describir la dispersión de la variación usando la menor cantidad de dimensiones posible.

Con el objetivo de estimar el número de componentes principales a utilizar, se puede emplear como herramienta básica un gráfico de porcentaje de varianza explicada, como el que se muestra en la figura 1.9 donde se observa el porcentaje de varianza explicada acumulativa en función del número de componentes principales. Se puede apreciar en él que existe una tendencia máxima a partir de la componente número 3 (en el ejemplo hipotético), lo que significa que el modelo está utilizando un alto porcentaje de información de los datos originales a partir de la componente 3.

Figura 1.9 Porcentaje de varianza explicada en función del número de componentes principales.

El uso de un mayor número de componentes sería erróneo, ya que la información contenida en ellos puede incorporar errores del sistema en vez información útil.

Otros parámetros que se evalúan en el modelo son el gráfico de loadings, el gráfico de scores, los resultados de la validación del modelo y los gráficos de residuales. El modelo es obtenido a partir de un determinado número de muestras, las cuales serán el objeto de estudio. Generalmente, el modelo es obtenido por validación cruzada o crossvalidación, que se expone a continuación.

1.3.3.2. Validación de modelos PCA

Una forma de validación para estimar los errores del modelo es a través de una validación cruzada o cross-validación. En el proceso de validación, la operación más utilizada es la de dejar una muestra afuera (leave one out), en donde se obtiene el modelo con n-1 muestras; el valor residual proveniente de la muestra que es dejada afuera de la serie de datos se computa para obtener la Raíz Cuadrada Media del Error de Cross Validación para PCA (RMSECV), que se calcula de la siguiente manera (ecuación 1.2):

Figura 1.9 Ecuación 1.2.

Un gráfico de RMSECV en función del número de componentes principales, como la que se muestra en la figura 1.10, mostrará una tendencia natural a disminuir, hasta llegar a un valor cercano a cero en el último componente principal útil en términos del modelo. El RMSECV es una medida de la magnitud de los residuos en el modelo PCA usando k componentes principales.

El término residual (i , j) es el residual de la i-ésima muestra en la j-ésima variable; nmuest es el número de muestras y nvar el número de variables [39]. La figura 1.10 es de suma importancia, ya que puede ser un complemento ideal para seleccionar el número de componentes principales en base al porcentaje de varianza explicada en la figura 1.9.

Figura 1.10 RMSECV en función del número de componentes principales.

1.3.4. Análisis de Agrupamientos

El análisis de agrupamientos, más conocido como análisis de clusters (CA), es una técnica no supervisada que examina las distancias entre todas las muestras y representa esa información en forma de un gráfico de dos dimensiones llamado dendograma, como se muestra en la figura 1.11 [53].

Estos dendogramas, presentan los datos provenientes de un espacio filas de grandes dimensiones (como por ejemplo variables instrumentales), facilitan la capacidad de reconocimiento del analista y puede proveer información adicional a la obtenida por PCA.

Para generar un dendograma, el análisis de clusters forma agrupamientos de muestras basados en su cercanía dentro del espacio filas. Existen diferentes maneras de hallar las distancias entre muestras y con ello, su cercanía o similitud entre sí. Por ejemplo, la combinación de amalgamamiento o conexión simple, cuadrática, centroide, método de Ward, etc, con distancias como las Euclídea Mahalanobis, Pearson, Manhatan, etc [39][53]. La información que brindan difiere entre sí, en el sentido de que ciertas combinaciones son más útiles que otras dependiendo de la relación que exista entre las muestras.

La figura 1.11 representa un dendograma típico, en donde en el eje y se incluyen las distancias, mientras que en el eje x se aprecian las similitudes entre grupos o clusters ( A, B, C). En el eje y los valores utilizados representan las distancias, mientras que los valores en el eje de las x dependen del criterio de agrupamiento seleccionado. En todos los casos, es conveniente realizar el análisis de clusters utilizando una combinación de varios métodos de conexión y de distancias, de tal manera de obtener la máxima información posible de las muestras [39].

Figura 1.11 Dendograma obtenido para un análisis de clusters hipotético.

1.3.5. Análisis Discriminante Lineal

El análisis de discriminante lineal (LDA) busca hallar funciones lineales de las variables independientes que permitan discriminar individuos en grupos definidos por la variable dependiente. Si existiera sólo una única variable independiente, el problema podría ser fácilmente resuelto mediante ANOVA de un factor. Como todo método supervisado, LDA requiere de dos etapas: entrenamiento y predicción. En la etapa de entrenamiento, un grupo de muestras es utilizado para obtener las llamadas funciones discriminantes o canónicas. En la etapa de predicción, muestras conocidas se predicen a través de las funciones discriminantes a fin de hallar el error de predicción del método.

La función discriminante D, también conocida como función canónica, es aquella que surge a consecuencia de un análisis LDA. D es una ecuación que es función de las Variables originales utilizadas en el modelo. Si el modelo es lineal, la ecuación general se puede definir como (ecuación 1.3):

D = a + b B + c C + d D

Ecuación 1.3.

siendo a, b, c y d los coeficientes de las variables originales A, B, C y D que tienen influencia en la clasificación.

LDA busca hallar la mínima relación entre los cuadrados medios dentro y los cuadrados medios totales, a través de un coeficiente conocido como lambda de Wilks (ecuación 1.4).

Ecuación 1.4.

Como resultado de un análisis LDA, se obtienen las tablas discriminantes o tablas de confusión, en donde se evalúa el porcentaje de muestras predichas correctamente, tanto sea en la etapa de entrenamiento como en la predicción. Asimismo, las funciones discriminantes conforman los límites (L) correspondientes a cada grupo de clasificación, lo cual puede apreciarse en la figura 1.12.

Ecuación 1.4.

Figura 1.12.Gráfico de las dos primeras funciones discriminantes.

1.3.6. Análisis Discriminante por Cuadrados Mínimos Parciales (PLS-DA)

El método de regresión por mínimos cuadrados parciales (PLS) es uno de los métodos de regresión más populares en quimiometría. En el año 1970 Herman Wold usó el término PLS para hacer sus primeros desarrollos en el área de la economía, pero fue su hermano Svante Wold quien llevo a cabo la primera versión quimiométrica para modelar datos con variables altamente correlacionadas. La versión original del método consiste en obtener una secuencia de modelos parciales ajustados por cuadrados mínimos de dos matrices (X e Y).

Dichos modelos son utilizados para encontrar simultáneamente las variables latentes (u ocultas) en X que mejor puedan predecir las variables latentes en Y [58]. Este método tiene su aplicación tanto en regresión (PLSR) como en clasificación (PLSDA).

El análisis discriminante por mínimos cuadrados parciales (PLS-DA) es un método de regresión lineal supervisada basado en la combinación de una matriz de datos X y una matriz de valores cualitativos Y (definidas como variables dummies), que consiste en una serie de vectores y que contienen números enteros que codifican para la clase en que las muestras fueron definidas, donde vector dentifica a determinada clase.

Una vez que las variables dependientes fueron definidas, la etapa siguiente es la construcción del modelo de regresión utilizando el método PLS. Como este método maximiza la relación entre la variable dependiente y los scores, se puede afirmar que las variables latentes representan las direcciones que mejor discriminan las clases, que definen la máxima separación entre ellas. Los valores de la variable dependiente estimados por el modelo final no son los números enteros atribuidos originalmente, pero si valores que deben estar próximos de los números originales, relacionados con el valor de corte para delimitar las clases. El número de factores óptimo del modelo es seleccionado evaluando la raíz cuadrada media del error de validación, calculado mediante validación cruzada [47].

Concluyendo, el objetivo del análisis discriminante es encontrar funciones lineales que mejor discriminen dos grupos para construir una regla de asignación para un objeto nuevo. A través de PLS-DA se logra tal objetivo, ya que se puede entender como una extensión de LDA. El propósito del método es obtener funciones que maximicen la varianza entre los grupos y minimicen la varianza dentro de los grupos.

1.4. BIBLIOGRAFIA

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1.5.HIPOTESIS

La obtención de modelos multivariados de clasificación quimiométrica basada en datos de perfil elemental, resultan una herramienta efectiva para determinar origen geográfico y otras características de cultivos de cereales basados en diversos aspectos, tales como: prácticas agronómicas, efectos topográficos, efectos genéticos, elementómica y marcas comerciales.

1.6. OBJETIVOS

1.6.1. Objetivos Generales

Determinar especies elementales en cultivos de cereales procedentes de la región pampeana mediante espectroscopía de emisión atómica por plasma microondas (MP-AES) y posterior análisis por métodos quimiométricos multivariados.

1.6.2. Objetivos Específicos

Evaluar diferentes tratamientos y preparación de muestras para una correcta mineralización a los fines de permitir su introducción por nebulización convencional.

Determinar el perfil elemental de una variedad de cultivos de interés agroalimentario de la región central del país, incluyendo maíz, soja, trigo, etc. Esto incluye la evaluación de las cualidades del método analítico propuesto (cifras de mérito, probables interferencias espectrales, efecto de matriz, grado de recuperación, etc.), así como el uso de adición de patrón y/o material de referencia certificado para la evaluación de exactitud.

Análisis de los datos analíticos obtenidos mediante programas quimiométricos, evaluando grupos de muestras que presenten similares respuestas según la concentración de elementos.

Obtener modelos clasificatorios a los fines de clasificar muestras de maíz según diferentes fenómenos, tales como:

Efecto de la topografía

Efecto de la densidad de siembra.

Influencia de la fertilización.

Efecto de la tecnología genética aplicada.

Influencia de las marcas comerciales.

Elementómica de maíz.

CAPÍTULO 2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1. REACTIVOS

2.1.1. Solución Patrón de Elementos Minoritarios

Se utilizó un patrón multielemental SCP SCIENCE Plasma CAL, con una matriz de ácido nítrico al 5 %, que contiene 100 mg L⁻¹ de: Ag, Al, As, Ba, Be, Cd, Co, Cr, Cu, Mn, Mo, Ni, Pb, Se, Th, Tl, U, V y Zn. A partir de este patrón, se realizaron las calibraciones de los elementos minoritarios.

Para el análisis de granos de maíz, las calibraciones se evaluaron en un rango de concentraciones entre 0,25 mg L⁻¹ - 1 mg L⁻¹. A todos los patrones se les adicionó HNO3(c) para simular la matriz ácida de digestión de la muestra llevando a un volumen final de 10 mL con agua ultrapura. Se preparó un blanco para cada calibración.

Para las hojas de maíz, las calibraciones se establecieron en un rango de concentraciones entre 0,2 mg L⁻¹ - 2 mg L-1 excepto para Al (1 mg L⁻¹ - 10 mg L⁻¹) y para Sr (0,1 mg L⁻¹ – 0,5 mg L⁻¹) que se realizaron rectas separadas. A todos los patrones se les adicionó HNO3(c) y HCl(c) para simular la matriz ácida de digestión de la muestra llevando a un volumen final de 15 mL con agua ultrapura. Se preparó un blanco de reactivos para cada calibración.

2.1.2. Solución Patrón de Elementos Mayoritarios

Se utilizaron patrones monoelementales SCP SCIENCE Plasma CAL de 1000 mg L⁻¹ para Ca, Fe, Mg, Na y P. Se realizó una calibración para cada uno los elementos mayoritarios. Para los granos de maíz, las calibraciones se evaluaron en un rango de concentraciones entre 0,1 mg L-1 – 0,4 mg L⁻¹. A todos los patrones se les adicionó HNO3(c) para simular la matriz ácida de digestión de la muestra llevando a un volumen final de 10 mL con agua ultrapura. Se preparó un blanco para cada calibración.

Para las hojas de maíz, las calibraciones se desarrollaron en un rango de concentraciones entre 10 mg L⁻¹ - 60 mg L⁻¹, excepto para K (1 mg L⁻¹ – 10 mg L⁻¹). A todos los patrones se les adicionó HNO3(c) y HCl(c), para simular la matriz ácida de digestión de la muestra llevando a un volumen final de 10 mL con agua ultrapura. Se preparó un blanco para cada calibración.

2.1.3. Material de Referencia Certificado de Maíz

Para la etapa de validación se utilizó un material de referencia certificado (CRM) de grano de maíz: NCS ZC73012 Mealie.

2.1.4. Ácidos

El HNO3 (concentrado al 65%, marca Merck p.a.) y HCl (concentrado al 37%, marca Merck p.a.), utilizados fueron destilados mediante un destilador de ácidos minerales con sistema sub-boiling marca Berghoff ®. De esta manera se obtuvieron ácidos concentrados ultrapuros y libres de metales.

2.1.5. Agua ultrapura

Para la preparación de todas las soluciones, se utilizó agua destilada, purificada mediante un ultrapurificador de agua Millipore® modelo ultrapure System (Mili-Q), con resistividad de 18,2 MΩ cm, a 25° C.

2.2. Instrumental

2.2.1. Espectrómetro de emisión atómica

Las mediciones se realizaron con un Espectrómetro de Emisión Atómica marca Agilent, modelo MP 4100 (figura 2.1), equipado con un autosampler Agilent modelo SPS3, nebulizador One Neb y una cámara de spray de doble paso.

La característica principal de este sistema de generación de plasma es la inclusión de un magnetrón industrial resistente y fiable, una tecnología de eficacia demostrada en hornos microondas. La aplicación de un campo magnético en lugar de uno eléctrico para acoplar la energía de microondas al plasma hace que el espectrómetro MP- 4100 produzca un plasma resistente, capaz de procesar fácilmente muestras complejas. La emisión de luz del plasma se dirige a un detector CCD de amplio intervalo y bajos niveles de ruido que permite la corrección simultánea de los fondos y proporciona unos límites de detección y una precisión óptimos.

Figura 2.1 Espectrómetro de Emisión Atómica marca Agilent MP 4100 y autosampler. Agilent SPS3 .

El espectrómetro MP-AES Agilent 4100 es más seguro ya que su mayor ventaja es que funciona con nitrógeno atmosférico, lo que reduce los costos operativos y elimina la necesidad de conectar fuentes de gas en el laboratorio o de transportar y manipular manualmente cilindros de gas.

Se utilizó el patrón de calibración de máxima concentración, para cada uno de los elementos minoritarios y mayoritarios, para optimizar los parámetros instrumentales del MPAES: a) posición de visualización, y b) presión de nebulización para todos los elementos. Para realizar la optimización se establecieron 13 segundos de toma de muestra, 15 segundos de estabilización antes de la lectura, y 5 segundos de tiempo de lectura para la medición de las emisiones de cada analito.

2.2.2. Horno Microondas

Para la digestión de las muestras se utilizó un equipo de digestión asistida por microondas Anton Paar MW 3000 (figura 2.2), que posee un rotor con una capacidad para 16 vasos.

Figura 2.2 Digestor microondas Anton Paar MW 3000..

2.3. MUESTREO

Las muestras se recolectaron en 14 sitios de la provincia de La Pampa con el propósito de abarcar la mayor superficie cultivada de la provincia (Figura 2.3). El muestreo se llevó a cabo durante los meses de septiembre de 2014 a marzo de 2015, que coincide con el periodo de cosecha del cultivo de maíz.

Se recolectaron un total de 86 muestras de maíz pertenecientes a parcelas controladas de: Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA), Facultad de Agronomía de la UNLPam y establecimientos agropecuarios privados de la provincia de La Pampa. En la Tabla 2.1 se pueden observar los sitios muestreados que se encuentran ordenados en forma creciente por la relación entre su precipitación media anual y su temperatura media anual.

Tabla 2.1. Número de muestras correspondiente a cada sitio de muestreo.

Sitios de muestreo

N° de Muestras

Sitios de muestreo

N°de Muestras

25 de Mayo*

2

Doríla*

4

La Gloria***

6

Santa Rosa**

4

Parera***

2

Uriburu***

2

Colonia Santa María***

1

Catrilo***

4

Macachín*

6

General Pico*

3

(Guatrache*

5

Anguil*

40

Realicó ***

3

General Acha*

4

N° total de muestras = 86

*Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA); **Facultad de Agronomía – UNLPam;
*** Establecimientos agropecuarios privados.

Figura 2.3 Sitios de muestreo de maíz en la provincia de La Pampa..

2.3.1. Almacenamiento de Muestras

Una vez recolectadas las muestras se secaron en estufa a 60 °C durante 24 horas; luego se separaron las diferentes partes del cultivo -tallo, hojas, marlo, grano, espiga, raíz- y suelo, y se las almacenaron en bolsas de polietileno. En todos los casos, tanto para la manipulación, almacenamiento y tratamiento de las muestras, se empleó material plástico para prevenir la contaminación por metales. El material plástico que se utilizó fue lavado previamente con una solución de ácido nítrico al 5 % (v/v), y posteriormente se lavó con agua con agua ultrapura.

2.4. Preparación de muestras de granos de maíz

Para el análisis de los granos de maíz, se tomaron las muestras acopiadas y se sometieron a molienda, para lo que se utilizó un molino para muestras vegetales 1095 Knifetec™. Este molinillo se encuentra diseñado para la preparación de muestras fibrosas, con alto contenido en grasa y humedad antes del análisis, como es el caso de los granos de maíz. El tiempo normal de preparación de muestras oscila entre 2-10 segundos obteniéndose como resultado un polvo homogéneo, el cual se pasó luego por un tamiz de 120 mesh. Una vez molida las muestras se almacenaron en frascos de polietileno (figura 2.4).

Figura 2.4 Muestras de grano de maíz molidas..

Previo a la mineralización del grano de maíz, las fracciones molidas se secaron en estufa durante 24 horas y luego se pesaron con exactitud 0,5 gramos de cada muestra.

2.4.1. Digestión asistida por ultrasonido

Una vez pesada la muestra, como se indica en el apartado 2.4, ésta se colocó en un tubo de polietileno de 50 mL tipo Falcon, se le agregó 5 mL de HNO₃ (concentrado destilado y libre de metales) y se llevó a baño María, bajo campana de extracción, durante 30 minutos a una temperatura de 100 °C. Posteriormente se sometió a un baño ultrasónico modelo TB04, el mismo periodo de tiempo que duró el calentamiento. Una vez finalizada la digestión, la muestra se enfrió y se llevó volumen final con agua ultrapura (Vf = 30 mL).

2.4.2. Digestión Asistida por Horno Microondas

Las muestras tratadas como se menciona en el apartado 2.4 se transfirieron a los vasos de 100 mL de politetrafluoroetileno (PTFE). Se agregaron 6 mL de HNO3(c) (destilado y libre de metales) y 2 mL de agua. Luego se llevaron al digestor de microondas (MW) donde se aplicó el programa de temperaturas que se detalla en la Tabla 2.2. Una vez finalizado el programa, la muestra ya mineralizada se transvasó a un tubo tipo Falcon de 50 mL y se enrasó con agua ultrapura (Vf = 30 mL).

Tabla 2.2. Rampa de calentamiento en digestor MW para granos de maíz

Etapa

Tiempo (min)

Temperatura (°C)

Rampa calentamiento

15

190

Mantenimiento

15

190

Rampa enfriamiento

30

0

Tiempo Total (min)

=60

2.4.3. Digestión del Material de Referencia Certificado de Maíz

Al igual que las muestras, 0,5 gramos del material de referencia certificado fueron sometidos a digestión ácida asistida por ultrasonido y digestión acida asistida por microondas siguiendo los procedimientos detallados en 2.4.1 y 2.4.2.

2.5. PREPARACIÓN DE MUESTRAS DE HOJAS DE MAÍZ

Al igual que los granos, las hojas de maíz fueron molidas para disminuir el tamaño y lograr una muestra más homogénea como muestra la figura 2.5; las muestras fueron tratadas como se menciona en el apartado 2.4.

La mineralización asistida por microondas se realizó siguiendo el programa de temperatura como se indica en la tabla 2.3. Para la digestión se utilizaron 6 mL de HNO3 (c) y 2 mL de HCl (c).

Figura 2.5 Muestras de hojas de maíz molidas..

Tabla 2.3. Rampa de calentamiento en digestor MW para hojas de maíz.

Etapa

Temperatura (°C)

Tiempo (min)

Rampa calentamiento

10

190

Mantenimiento

15

190

Rampa enfriamiento

20 0

0

Tiempo Total (min)

= 45

2.6. ANÁLISIS ESTADÍSTICO

El análisis de comparación de medias se realizó mediante prueba test t para medias de dos muestras emparejadas, con un 95 % de nivel de confianza.

Para la obtención de los modelos multivariados PCA, CA y LDA se utilizó el paquete de software quimiométrico The Unscrambler X 10.5. Este software se encuentra diseñado con una interfase para usuario accesible que le permite importar las matrices de datos desde cualquier planilla de cálculo, obtener gráficos específicos referidos a los modelos obtenidos, que ayudan a interpretar y a optimizar los mismos en poco tiempo si es que no existe otro tipo de fuente de error adicional.

Esto facilita enormemente la tarea para el tratamiento de datos y evita pérdidas de tiempo en la trascripción de estos, sumado a ello la posibilidad de error que es posible cometerse durante el proceso por parte del operador, habida cuenta de que cada patrón o muestra puede estar constituido por cientos de datos.

CAPÍTULO 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3.1. Empleo de agitación por ultrasonidos para el pretratamiento de muestras en el análisis multielemental de maiz por medio de espectroscopia de emisión atómica con plasma de microondas.

La actividad agrícola es uno de los pilares fundamentales sobre los cuales se construye la economía argentina [1][2]. Debido a esta contribución, la evaluación de ciertas especies químicas que afectan la calidad nutricional en los cultivos se hace relevante. El perfil multielemental constituye un importante factor de calidad del cultivo en relación con el estrés fisiológico, así como para la salud humana, debido a su importancia en los sistemas biológicos y en la calidad de los productos alimenticios[3] .

La absorción y acumulación de metales pesados y oligoelementos en plantas depende del transporte desde la solución del suelo hasta las raíces, desde los tallos hasta las hojas, así como desde las hojas hasta los tejidos de almacenamiento de la planta (como semillas, granos o frutas) [4][7]. Desde el punto de vista nutricional de la planta, se requieren al menos 14 elementos minerales para una actividad fisiológica completa. Según el elemento, el rango de concentración varía de> 10,000 μg g-1 (por ejemplo, Ca, N, K), a 0,001 μg g-1 (por ejemplo, Mo). Cada elemento se requiere dentro de un rango óptimo que, si se excede, inducirá síntomas de deficiencia o toxicidad con consecuencias para la salud y la supervivencia de las plantas, lo que también afectará la calidad del alimento [4][7].

Se han realizado varios estudios sobre el efecto de los metales en algunos cultivos, centrándose en suelos contaminados o fertilizados, donde se observa la influencia de esos metales en el desarrollo de la planta. De esta manera, se han informado algunos estudios de determinación elemental sobre semillas de maíz en suelos contaminados [8][10]. Dado que la producción de maíz es relevante en Argentina, donde se utiliza como fuente de alimento, es importante conocer el perfil elemental de las semillas, dado que existen muy escasas referencias previas sobre el tema en nuestro país.

El estudio del perfil elemental en organismos vivos requiere el desarrollo de diferentes metodologías analíticas. Por lo tanto, es necesario contar con técnicas modernas, sensibles y selectivas debido a los bajos niveles de concentración de elementos en las muestras, así como en las matrices complejas donde estos se pueden encontrar. MPAES es uno de los métodos analíticos más versátiles disponibles en la actualidad. Las principales ventajas están relacionadas con la detección simultánea de múltiples elementos, alta sensibilidad, amplio rango de respuesta lineal y el bajo nivel de ruido en comparación con otros métodos, lo que permite la detección de un gran número de elementos que van desde los metales alcalinos, tierras raras y elementos de transición o incluso algunos no metales siendo superada solo por espectroscopía de emisión atómica acoplada a espectrometría de masas (ICPMS) [11][13].

En el análisis elemental de plantas, la preparación de la muestra constituye una etapa crítica en el procedimiento analítico. Las matrices orgánicas representan un reto para los sistemas de introducción convencionales en el espectrómetro de emisión, ya que pueden ocasionar problemas como por ejemplo la inestabilidad del plasma, remanente de materia orgánica e interferencias, entre otros. La complejidad de la matriz orgánica del maíz, debido a su alto contenido de almidón, grasa y fibra, requiere una minuciosa mineralización antes de la determinación multielemental.

Esto lleva al aumento de tiempo de análisis para un gran número de muestras, pero también aumenta la probabilidad de contaminación por la introducción de etapas previas pasos.

3.1.1. Objetivo

Desarrollar una metodología analítica para la preparación de muestras de granos de maíz, alternativa al sistema de microondas convencional, implementando una mineralización simple y rápida asistida por ultrasonido (US) mediante tratamiento en medio ácido para una posterior determinación multielemental por MPAES.

3.1.2. Optimización de las Variables Instrumentales

Se identificaron las variables instrumentales del MPAES, cuya fluctuación podría tener un efecto sobre la intensidad analítica. Entre ellas se optimizaron la presión de nebulización, la posición de visualización y la longitud de onda de cada analito. Para esto se procedió a la realización de múltiples mediciones de la intensidad de señal de los analitos respecto a la fluctuación de cada una de estas variables de manera individual. Para ello, se mantuvieron constantes las variables del tiempo de toma de muestra (13s), lavado (20s) y estabilización del plasma (15s) y la velocidad de bombeo en la que ingresa la muestra (15s).

3.1.2.1. Posición de visualización

El plasma de microondas está orientado verticalmente para mejorar el manejo de la matriz, pero también tiene una visualización axial que permite obtener una sensibilidad óptima y mejores límites de detección.

El siguiente esquema (Fig. 3.1) representa el diagrama óptico interno que contiene el MPAES y permite observar cómo variando los grados de la posición de visualización de la antorcha variaría la intensidad de la señal detectada en función de la relación señal/ruido para poder obtener así la óptima señal analítica de los elementos que se deseen cuantificar.

Figura 3.1 Diagrama óptico interno del MPAES [14].

Para optimizar las condiciones instrumentales, inicialmente se evaluó la mejor posición de visualización en el instrumento. Se optimizó la posición de visualización del plasma para cada elemento a una longitud de onda específica para ese elemento y así alcanzar el mejor rendimiento analítico. La Figura 3.2 muestra los resultados obtenidos para la calibración óptica utilizando soluciones estándar.

Figura 3.2 Posición de visualización en MPAES en función de SBRB (relación señal/ fondo) para obtener la señal analítica óptima.

3.1.2.2. Presión de nebulización

Para obtener la señal analítica más alta, se optimizó para cada elemento la presión del nebulizador. Los cambios de la señal analítica en función de la presión del gas en el nebulizador se muestran en la figura 3.3. En casi todos los casos, todos los elementos tuvieron la mejor señal cerca de 200 kPa. La tabla 3.1 resume los parámetros optimizados para cada uno de los elementos analizados.

Figura 3.3 Cambios en la señal analítica al aumentar la presión del nebulizador en función de SBRB (relación señal/fondo).

Tabla 3.1 Parámetros optimizados para la determinación de metales por MPAES.

Analito

Posición de Visualización

Presión de nebulización (Kpa)

Ag

0

200

Al

0

220

Ba

0

200

Be

-10

120

Ca

0

100

Cd

-10

140

Co

-10

220

Cr

0

240

Cu

0

180

Fe

-10

200

Mg

-10

200

Mn

0

240

Mo

-10

240

Na

0

240

Ni

-10

160

Pb

40

80

V

-10

240

Zn

-10

160

3.1.2.3. Selección de la longitud de onda óptima

El software Agilent MP Expert contiene una biblioteca de espectros donde recomienda utilizar para el análisis aquella longitud de onda que posea la mayor intensidad de señal analítica (figura 3.4) [14]. Además, este software resalta las interferencias que tiene el elemento a determinar a medida que se van seleccionando las longitudes de onda de los demás analitos involucrados en el análisis.

Con motivo de aumentar la sensibilidad y lograr una buena selectividad en la determinación multielemental, se evaluaron las longitudes de onda a ser utilizadas para la cuantificación de cada analito.

Figura 3.4 Diferentes intensidades de señal analítica a diferentes longitudes de onda para el elemento Zn.

3.1.3. Calibración

El MPAES permite la determinación multielemental. Por este motivo, la calibración se separó en dos grandes grupos: elementos minoritarios y elementos mayoritarios, a fin de disminuir los tiempos de análisis y evitar posibles interferencias entre ellos. Se utilizaron soluciones estándares acuosas certificadas preparadas tal como se indicó en los apartados 2.1.1 y 2.1.2 del capítulo anterior. Los datos de las calibraciones halladas se resumen en la Tabla 3.2.

Tabla 3.2. Rectas de calibración para los diferentes analitos y sus respectivas longitudes de onda.

ELEMENTOS MINORITARIOS

Analito

Longitud de onda (nm)

Ecuación de la recta

R²

Ag

328,068

y = 64354x + 916,7

0,997

Al

396,152

y = 18969x + 128,5

0,998

Ba

455,403

y = 52795x – 423

0,999

Be

234,861

y = 60190x + 1912

0,999

Cd

228,802

y = 31448x + 323

0,999

Co

340,512

y = 9753x + 2096

0,995

Cr

425,433

y = 32297x - 132,7

0,999

Cu

324,754

y = 158289x - 1530,5

0,999

Mn

403,076

y = 35176x - 140,5

0,999

Mo

386,410

y = 21557x + 65,3

0,999

Ni

352,454

y = 21718x - 71,5

0,999

Pb

283,305

y = 2545x – 60

0,999

Tl

535,046

y = 13829x - 38,6

0,999

V

437,923

y = 3428x - 14,5

0,999

Zn

481,053

y = 498,1x + 2,4

0,999

ELEMENTOS MAYORITARIOS

Ca

422,673

y = 3E+06x - 26745

0,993

Fe

259,941

y = 9890x + 126,6

0,998

Mg

383,829

y = 10159x - 484,6

0,997

3.1.4. Cifras de Mérito

El límite de detección (LOD) se calculó como 3,3 veces la desviación estándar de los blancos y el límite de cuantificación (LOQ) se obtuvo como 10 veces desviación estándar de los mismos, considerando la ecuación de calibración de cada elemento [15]. Las cifras de mérito alcanzadas se pueden observar en la Tabla 3.3.

Tabla 3.3. Cifras de mérito obtenidas para los analitos estudiados.

Analito

LOD

[mg.kg⁻¹]

LOQ

[mg.kg⁻¹]

RSD

[%]

Ag

0,19

0,58

5,09

Al

17,24

52,24

6,77

Ba

0,03

0,09

1,48

Be

0,89

2,70

5,16

Ca

0,13

0,39

1.01

Cd

0,47

1,42

3,51

Co

4,94

14,98

5,10

Cr

0,09

0,26

5,67

Cu

0,51

1,55

7,42

Fe

1,34

4,05

2,15

Mg

0,23

0,68

2,33

Mn

0,08

0,25

5,32

Mo

0,21

0,63

4,32

Ni

0,28

0,86

6,86

Pb

31,87

96,57

37,79

Tl

0,11

0,33

5,30

V

0,23

0,69

4,60

Zn

1,67

5,06

3,43

Los límites de detección alcanzados se hallaron en un rango entre 0,03 mg. kg⁻¹ para Ba a 17,24 mg. kg⁻¹ para Al, mientras que los límites de cuantificación se hallaron en un rango entre 0,09 mg. kg⁻¹ a 52,24 mg. kg⁻¹ respectivamente.

La precisión se evaluó como la desviación estándar relativa de nueve determinaciones repetidas de un patrón intermedio de la recta de calibración. Las precisiones satisfactorias se encuentran en valores menores al 10 %, las cuales son difíciles de alcanzar cuando se analizan soluciones con matrices con alto contenido de materia orgánica [16][18]. Sin embargo, se obtuvieron precisiones menores a 7,42 % para todos los metales, con excepción del Pb, el cuál es un elemento poco sensible para la determinación por MPAES, y cuyo valor de RSD% fue muy alto.

3.1.5. Optimización del Pretratamiento de Muestra

Conocer las propiedades fisicoquímicas de una muestra que se va a analizar es fundamental para una mineralización eficiente. Por ello, es importante considerar el tipo de muestras para así poder seleccionar la mejor estrategia de disolución o digestión [18]. Como el maíz posee una matriz orgánica compleja, como consecuencia del alto contenido de almidón, grasa y fibra, requiere una mineralización completa. En consecuencia, los tratamientos de la muestra desarrollados en esta tesis se centraron en alcanzar una mineralización completa para una adecuada introducción de muestra al MPAES y obtener mejores resultados.

Por este motivo, se desarrolló un nuevo tratamiento basado en la mineralización asistida por ultrasonidos. En general se observa que la agitación ultrasónica disminuye el tiempo de digestión y permite utilizar soluciones ácidas más diluidas cuando se compara con métodos frecuentemente utilizados en los laboratorios de análisis químicos como la agitación manual, mecánica o magnética. Sin embargo, una mineralización cuantitativa depende fuertemente de la interacción de los analitos con su matriz. En este sentido, aunque los métodos asistidos por ultrasonidos son prometedores, es recomendable que las variables que influyen en la mineralización de los analitos sean minuciosamente evaluadas para diferentes tipos de muestras antes de la utilización de esta estrategia, a fin de evitar posibles errores sistemáticos en el análisis [18].

Tratándose de una muestra con una matriz de alto contenido orgánico, y con el fin de encontrar la mejor disolución del grano de maíz evitando condiciones químicas extremas, se experimentaron diversos tratamientos con HNO₃ (reactivo utilizado en la digestión en horno microondas) variando la concentración de este desde 5 a 30 %. Además, se evaluó la masa de muestra para utilizar en la digestión en un rango de 0,1 a 1 g. Se estudió la temperatura y tiempo de exposición en el baño María, desde 60 a 100 °C, y 15 a 60 minutos, respectivamente; y se experimentó el tiempo necesario en baño ultrasónico (con una potencia de 160W y una frecuencia 40 KHz) para acelerar la digestión, desde 15 hasta 60 minutos.

Previamente se realizaron otros tratamientos mediante ultrasonidos: alcalinos (con hidróxidos de sodio, de tetrametil-amonio y de amonio), con ácidos orgánicos (ácidos fórmico y acético glacial), con solventes orgánicos (dimetilformamida y tetrametilamina), evaluando también la cantidad de muestra, temperatura y tiempo de exposición en el baño María, al igual que en el tratamiento con HNO₃ mencionado antes. Este tipo de tratamientos no proporciono una mineralización óptima de la muestra de maíz, por lo cual se consideraron como tratamientos ineficientes.

La figura 3.5 muestra la comparación de tres pretratamientos de muestras: a) tratamiento convencional por horno microondas, b) tratamiento donde las condiciones experimentales no proporcionaron una digestión óptima de la muestra y c) tratamiento propuesto en donde la combinación de variables utilizadas en el pretratamiento promovió una disminución del tamaño de las partículas, obteniéndose una solución trasparente, manifestando así, la digestión total de la matriz.

Figura 3.5 a) Tratamiento convencional (MW). b) Tratamiento ineficaz. c) Tratamiento propuesto (US).

3.1.6. Comparación del Tratamiento Convencional con el Tratamiento Propuesto

Con el motivo de evaluar si el pretratamiento propuesto asistido por ultrasonido (US) es comparable al tratamiento convencional de digestión por horno microondas (MW), se eligieron de manera aleatoria 3 de las 86 muestras de granos de maíz (muestras A, B y C). Luego de su mineralización se procedió a la determinación multielemental por MPAES.

Los valores de concentraciones que no presentaron diferencias significativas para ambos tratamientos (test t, α= 0,05) se indican en la Tabla 3.4. Sin embargo, para el caso de ciertos elementos minoritarios como Ag, Al, Ba, Be, Cd, Co, Mo, Pb, Tl y V, se observaron diferencias significativas entre los tratamientos. Se realizó un gráfico de barras, para una mejor visualización y comparación de los resultados con los elementos factibles de analizar (figura 3.5).

El método propuesto se comparó estadísticamente con una mineralización asistida por microondas convencional utilizando la prueba t (α=0.05) y se pudo observar que no hubo diferencias significativas entre los tratamientos demostrando así que el método de mineralización asistida por ultrasonido se puede proponer como una opción interesante y económica para el pretratamiento de muestras de granos de maíz.

Tabla 3.4. Comparación de los métodos de mineralización por horno microondas (MW) y el método propuesto asistido por ultrasonido (US) (n=3)

ANALITO

Muestra A

Muestra B

Muestra C

[mg. kg⁻¹]

MW

US

MW

US

MW

US

Ca

10,0

±

1,1

9,8

±

1,0

6,9

±

1,0

6,6

±

0,8

4,2

±

0,2

4,3

±

0,2

Cr

0,21

±

0,01

0,19

±

0,03

0,15

±

0,03

0,14

±

0,04

0,38

±

0,03

0,41

±

0,05

Cu

3,33

±

0,04

3,31

±

0,07

2,34

±

0,14

2,31

±

0,14

1,75

±

0,04

1,78

±

0,06

Fe

19,8

±

1,4

20,2

±

1,2

15,5

±

0,8

14,7

±

1,0

16,7

±

0,8

16,2

±

1,1

Mg

77,5

±

2,3

78,3

±

2,6

48,8

±

1,0

49,5

±

0,9

58,3

±

1,1

59,2

±

0,6

Mn

8,8

±

0,6

9,0

±

0,5

4,8

±

0,3

4,5

±

0,4

3,7

±

0,1

3,6

±

0,08

Ni

0,32

±

0,05

0,35

±

0,04

0,32

±

0,04

0,34

±

0,04

0,31

±

0,02

0,33

±

0,03

Zn

19,9

±

1,1

20,3

±

0,8

15,5

±

0,5

16,1

±

0,2

10,9

±

0,4

10,2

±

0,6

Figura 3.6 Concentraciones encontradas en las muestras A, B y C y sus respectivos desvíos para los analitos que no presentaron diferencias significativas en los tratamientos por MW y US.

Figura 3.6 Concentraciones encontradas en las muestras A, B y C y sus respectivos desvíos para los analitos que no presentaron diferencias significativas en los tratamientos por MW y US.

Figura 3.6 Concentraciones encontradas en las muestras A, B y C y sus respectivos desvíos para los analitos que no presentaron diferencias significativas en los tratamientos por MW y US.

Por otro lado, es importante destacar que el sistema de microondas tiene un rotor de 16 posiciones que permite mineralizar solo unas pocas muestras, mientras que el tratamiento asistido por ultrasonido propuesto permite mineralizar un mayor número de muestras en un menor período de tiempo. Por lo tanto, a pesar de que el horno de microondas es seguro para el usuario, el método asistido por ultrasonido tiene ventajas por su bajo costo y tiempo de análisis.

Los dos métodos de pretratamiento de muestra se compararon a través de un gráfico de correlación como muestra la figura 3.7. En el eje x se indican las concentraciones de las muestras (tomadas aleatoriamente) arrojadas por el tratamiento convencional y en el eje y, las obtenidas por el procedimiento propuesto en este trabajo. Cada punto del gráfico representa una muestra de grano de maíz única mineralizada por ambos métodos. Si cada muestra llevara a obtener el mismo resultado para ambos tratamientos, la recta de regresión tendría su ordenada en el origen cero y una pendiente y coeficiente de correlación de uno (y= x; r²=1) [19], tal como está señalada en el gráfico. Llevado a la práctica de laboratorio, como se puede observar en la figura 3.7, esto se cumple para la mayoría de los casos. La recta obtenida fue: y = 0,9418x + 0,5047 con un r²= 0,9889, valores que se encuentran cercanos a los parámetros ideales.

Los resultados comparativos obtenidos en este ensayo no están alejados de la recta ideal, salvo para el Mg. También se aprecia que a medida que aumenta la concentración de los analitos, se evidencia un aumento de la dispersión de los datos, lo cual es debido al aumento de los errores aleatorios que se observan en el método propuesto, situación apreciable para Mg principalmente. A pesar de ello, la diferencia de costos instrumentales justifica la posibilidad de empleo de ultrasonidos como alternativa económica, pudiendo ser recomendable para una amplia gama de elementos en muestras de maíz.

Figura 3.7 Correlación entre las concentraciones encontradas para los dos pretratamientos.

Es importante destacar que la mineralización completa de los analitos depende fuertemente de la matriz en la que se encuentran y de su interacción con los reactivos a la hora de llevarse a cabo la digestión. Al mismo tiempo, el tamaño de partículas de una muestra sólida tiene un papel fundamental en la estabilidad de las suspensiones durante la aspiración, transporte e introducción de muestra, así como la eficiencia de atomización. Es deseable en el análisis por MPAES, que las partículas sean eficientemente transportadas a través del sistema de introducción de muestras y que los procesos de descomposición de las partículas, así como la atomización excitación de los analitos sean idénticos a aquellos obtenidos con las soluciones de calibración [18].

A partir de los resultados obtenidos, se puede observar que, en la mayoría de los casos, la digestión por horno microondas tiene una mejor precisión en comparación con el tratamiento asistido por ultrasonido.

Esto se debe a que el horno microondas posee un sistema hermético cerrado que permite la descomposición completa de las muestras a altas presiones y temperaturas, evitando la volatilización de los analitos y pérdida de muestra. Además, la radiación microondas a la que son expuestas las muestras es homogénea en términos de potencia y tiempo. Por su parte, el tratamiento propuesto es un sistema abierto, donde las condiciones de mineralización son marcadamente distintas a las del sistema microondas. Asimismo, se debe tener en cuenta que la posición de los tubos en la que se encuentran las muestras en el baño ultrasónico puede intervenir reduciendo la eficiencia de la mineralización de analitos, ya que la energía de las ondas ultrasónicas puede ser diferente [18][20].

En el caso de los elementos Ag, Al, Ba, Be, Cd, Co, Mo, Pb, Tl, y V, diversos factores pueden haber influido en que los resultados de los tratamientos por microondas y asistido por ultrasonido no sean comparables, probablemente debido a su baja concentración en la muestra. Sin embargo, a fin de evaluar fehacientemente los errores sistemáticos producidos sobre estos elementos, en 3.1.9 se realizó un ensayo de adición de patrón para evaluar efectos de matriz sobre los analitos.

3.1.7. Validación Analítica Frente a MRC

Para evaluar la presencia errores sistemáticos durante la etapa de mineralización asistida por ultrasonido, la metodología propuesta se validó frente al MRC que se preparó de idéntica forma que las muestras.

Los promedios de las concentraciones de los analitos Ca, Cu, Fe, Mg, Mn y Zn encontrados en las muestras se observan en la Tabla 3.5. Se puede apreciar en la tabla que no se observan diferencias significativas en Ca, Cu, Fe, Mg, Mn, y Zn.

Respecto a Ni y Cr no se pudieron evaluar debido a que sus LOD y LOQ obtenidos para el sistema US son mayores a las concentraciones especificadas en el CRM. En la Figura 3.8 se grafican las concentraciones de referencia del CRM y las concentraciones encontradas luego del tratamiento propuesto de digestión asistida por ultrasonido.

Tabla 3.5. Resultados de la validación analítica del método propuesto.

Analito

CRM NCS ZC

73010

US

t cal *

Ca

55

±

8

54,3

±

7,6

0,75

Cu

0,66

±

0,08

0,69

±

0,07

3,05

Cr

(0,11)

LOQ

Fe

13,3

±

1,5

13,8

±

1,6

2,89

Mg

180

±

20

179

±

22

0,22

Mn

1,55

±

0,08

1,59

±

0,03

3,27

Ni

0,097

±

0,014

ND

Zn

2,9

±

0,3

2,85

±

0,33

0,5

() Indica sólo un valor de referencia.* t critico 4.3

Figura 3.8 Concentraciones del CRM y concentraciones halladas luego de ser tratada con US.

3.1.8. Aplicación Analítica: Determinación del perfil elemental en muestras de semilla de maíz de la provincia de La Pampa

Se prepararon las 86 muestras de granos de maíz, cada una por triplicado, lo que llevó a realizar un total de 258 análisis con el pretratamiento propuesto de digestión asistida por ultrasonido. Las concentraciones de los 8 analitos evaluados (Ca, Cu, Cr, Fe, Mg, Mn, Ni y Zn) fueron determinadas por MPAES. Los resultados se muestran en la tabla 3.6, como el promedio de cada una de las muestras obtenidas en cada sitio muestreado con tres réplicas por muestra y tres lecturas instrumentales por cada réplica.

El tiempo de digestión disminuyó notablemente al preparar las muestras por el método propuesto en comparación al sistema microondas. También aumentó la cantidad de muestras mineralizadas por unidad de tiempo comparándolo con la digestión asistida por microondas, en donde sólo se pueden tratar 16 muestras por ciclo (tamaño máximo del rotor) y cada uno de estos ciclos demora aproximadamente 120 min desde que ingresa la muestra al digestor de microondas (se mineraliza la muestra, se enfría y se transvasa y enrasa en el tubo) y hasta que se realiza el ciclo completo de lavado de los tubos de teflón para realizar una nueva digestión.

Es por ello que el nuevo método de pretratamiento de muestra asistido por ultrasonido es simple, rápido y efectivo para la digestión de granos de maíz y posterior determinación multielemental de Ca, Cr, Cu, Fe, Mg, Mn, Ni y Zn por MPAES.

Si se desea mineralizar otras muestras de granos diferentes al de maíz, será necesario evaluar las variables que influyen en la digestión de los analitos antes de la utilización de esta técnica de pretratamiento de muestra.

Tabla 3.6. Concentraciones promedio de las muestras de granos de maíz analizadas por MPAES (n=86).

ANALITO [mg kg ⁻¹]

Lugar de Muestreo

Ca

Cr

Cu

    Fe

        Mg

Mn

Ni

Zn

25 de Mayo

3,24

±

0,41

0,47    ±    0,08

1,69

±

0,08

12,32

±

1,77

63

±

5

5,78

±

0,58

0,57

±

0,07

17,19

±

1,22

La Gloria

5,73

±

1,04

0,42    ±    0,06

3,47

±

0,21

16,52

±

1,18

77

±

9

7,39

±

0,66

0,51

±

0,03

18,33

±

1,8

Parera

9,51

±

0,93

0,31    ±    0,03

4,74

±

0,11

53,72

±

8,88

77

±

6

12,79

±

2,22

0,36

±

0,08

23,87

±

2,38

Santa Maria

5,48

±

0,16

<LOQ

3,45

±

0,07

19,08

±

0,99

45

±

3

6,37

±

0,76

0,49

±

0,01

22,59

±

1,61

Macachin

4,21

±

0,34

0,37    ±    0,03

2,16

±

0,18

25,47

±

2,08

117

±

12

7,10

±

0,55

0,41

±

0,06

18,85

±

1,45

Guatrache

4,32

±

0,86

0,38    ±    0,03

2,43

±

0,11

23,84

±

2,17

106

±

17

7,06

±

0,58

0,39

±

0,02

19,51

±

1,75

Realicó

11,06

±

1,57

<LOQ

2,25

±

0,35

17,04

±

2,38

55

±

6

13,4

±

1,82

0,37

±

0,04

17,91

±

2,66

Dorila

3,51

±

0,53

0,42    ±    0,09

2,38

±

0,18

29,61

±

3,68

71

±

7

5,24

±

1,18

0,47

±

0,1

15,27

±

1,18

Santa Rosa

4,91

±

0,59

<LOQ

2,93

±

0,36

16,12

±

0,87

48

±

4

5,42

±

1,18

0,44

±

0,07

18,12

±

1,04

Uriburu

5,42

±

0,39

0,38    ±    0,07

1,88

±

0,17

15,35

±

2,07

54

±

6

6,22

±

0,92

0,47

±

0,07

14,79

±

0,94

Catriló

4,34

±

0,49

<LOQ

1,72

±

0,16

13,51

±

1,53

51

±

8

5,42

±

0,66

0,41

±

0,03

12,87

±

1,26

Gral. Pico

4,75

±

0,58

<LOQ

2,63

±

0,34

15,39

±

1,85

58

±

9

6,17

±

0,84

0,46

±

0,02

14,61

±

0,48

Anguil

6,59

±

0,96

0,49    ±    0,09

2,56

±

0,37

15,05

±

2,35

72

±

9

5,92

±

0,7

0,48

±

0,06

17,12

±

1,28

Gral. Acha

7,04

±

0,63

0,33    ±    0,06

3,33

±

0,35

14,76

±

3,51

58

±

7

6,81

±

1,39

0,41

±

0,05

14,65

±

1,46

3.1.9. Validación Analítica Mediante Adición del Patrón

Como ya se mencionó, debido a que ciertos elementos minoritarios como Ag, Al, Ba, Be, Cd, Co, Mo, Pb, Tl y V, proporcionaron diferencias significativas entre los pretratamientos de muestra descriptos anteriormente, se decidió realizar en esta instancia, un ensayo de recuperación mediante la adición de patrón como complemento a la validación realizada con el material de referencia certificado. Para esto, se adicionaron concentraciones conocidas de cada uno de los elementos a un total de 10 muestras; éstas se prepararon por triplicado agregando 10 μg.g⁻¹ de patrón multielemental SCP SCIENCE Plasma CAL que se describe en la sección 2.1.1 previo a la mineralización asistida por ultrasonidos (para Ag, Al, Ba, Be, Cd, Co, Mo, Pb, Tl y V), así como 300 μg.g-1 de patrón monoelemental SCP SCIENCE Plasma para P, que se describe en la sección 2.1.2.

Las recuperaciones individuales obtenidas para cada elemento variaron del 82,8 al 106,4% como se describe la tabla 3.7. Los resultados obtenidos en este ensayo permitieron decidir que el pretratamiento propuesto asistido por ultrasonido fue adecuado para determinar elementos minoritarios como Ag, Al, Ba, Be, Cd, Co, Mo, Pb, Tl y V y también P.

Tabla 3.7: Grado de recuperación obtenido (n=10)

Analito

Recuperación (%)

SD

Ag

97,7

2,4

Al

106,4

5,0

Ba

101,2

4,3

Be

82,8

7,3

Cd

99,6

2,6

Co

98,2

2,4

Mo

98,1

3,5

P

99,2

5,0

Pb

87,2

2,9

Tl

101,2

1,4

V

97,3

3,3

3.2. Clasificación de granos de maiz según marcas comerciales a partir de la determinación elemental mediante MPAES

El progreso de la biotecnología produjo una revolución desde el punto de vista de la protección de cultivos que permite alcanzar mejores rendimientos y compensar la caída del área cultivada con mayor productividad. En los últimos años, la innovación tecnológica derivó en el aumento del rendimiento de los cultivos. Se espera que esta tendencia continúe debido al aumento progresivo en el uso de semillas modificadas genéticamente, así como con el uso de suministros para su producción, como agroquímicos, fertilizantes y maquinaria, entre otros, que ofrecen mayor seguridad y estabilidad en el rendimiento en la cosecha [21]. Como resultado, los requerimientos para la producción de maíz son considerables año a año.

Las variedades premium de semilla tienen un precio más alto debido a que una mejor variedad de semilla conduce a una mayor producción y a mayores ganancias. Como consecuencia, algunos expendedores de semillas etiquetan en forma fraudulenta variedades de semillas de baja calidad como de alta calidad y las venden a los agricultores como tales para aumentar su margen de beneficio. Este comportamiento compromete los intereses de las empresas que desarrollaron una variedad de semillas de calidad superior y perturba el orden del mercado de semillas.

Por lo tanto, la identificación precisa de las variedades de semillas se ha vuelto cada vez más importante para el desarrollo del mercado de semillas de maíz y para proteger los intereses de los agricultores y los propietarios de variedades de semillas de alta calidad.

La calidad de la semilla, en términos de producción y para muchos laboratorios, se basa casi exclusivamente en una determinación del 80-90% de pureza y germinación. Sin embargo, hay otros componentes de la calidad de las semillas entre los cuales se encuentra la marca de origen, especialmente en el caso de las semillas híbridas. Es evidente que la variedad de semillas tiene una profunda influencia en la producción económica de los cultivos, afectando su establecimiento, desarrollo y rendimiento. Sumado a esto, en muchos sistemas de producción modernos son requeridas semillas de alta calidad [22]. Existen varios estudios sobre la autenticación de variedades de semillas de maíz en las que la pureza de las semillas de maíz se determina mediante pruebas bioquímicas. Se han utilizado proteínas especiales para identificar variedades de semillas [23], marcadores de ADN basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) [24][25] y marcadores moleculares basados en el polimorfismo del ADN [26]. Sin embargo, estos métodos demandan mucho tiempo de análisis.

La calidad nutricional del grano de maíz es un indicador y predictor de la calidad del cultivo[1] , por lo que es relevante evaluar el perfil elemental del mismo para encontrar las características de la composición elemental, así como los posibles modelos de clasificación quimiométricos para detectar diferentes calidades de semillas de maíz.

3.2.1. Objetivo

Implementar el método de clasificación supervisada, a través de análisis discriminante lineal (LDA) en los datos de la composición elemental de los granos de maíz, determinada mediante espectrometría de emisión atómica por plasma generado por microondas (MPAES), con el fin de clasificar los cultivos de maíz según sus marcas comerciales.

3.2.2. Análisis Multielemental

El análisis multielemental se llevó a cabo mediante el uso de MPAES según lo descrito en 3.1.2 y el tratamiento de las muestras se realizó mediante digestión asistida por ultrasonidos según se detalla en 2.4.1.

3.2.3. Análisis Estadístico

3.2.3.1. Análisis Discriminante Lineal (LDA). Funciones Discriminantes

Se analizaron un total de 32 muestras de granos de maíz, que se muestran en la tabla 3.8, las cuales fueron muestreadas de parcelas controladas pertenecientes al Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Estación Experimental Agropecuaria Anguil (INTA. EEA-Anguil).

Se realizó la discriminación de las muestras utilizando un análisis de discriminante lineal (LDA). Mediante esta técnica se pudo construir un modelo de clasificación utilizando los datos de los objetos, llamados variables predictoras (en este caso, las concentraciones de los elementos) cuyas categorías pertenecen a muestras (objetos) conocidas y conforman el conjunto de datos de entrenamiento. Así, el algoritmo matemático discrimina las muestras de maíz (objetos) en marcas (categorías dadas). Por su parte, existe además otro conjunto de muestras (conjunto de predicción) que permite validar el modelo. [27].

La matriz de datos fue construida con 7 columnas que contenían la concentración de los elementos como variables predictoras (Ca, Cu, Fe, Mg, Mn, Ni y Zn) y una columna adicional que incluyó la marca de cada muestra como variable categórica: Sciences (A), Monsanto (B), Syngenta (C), KWS (D), Pioneer (E) y Don Mario (F). Así, los datos se organizaron en una matriz de dimensión 32 x 8. A partir del conjunto de entrenamiento se construyó el modelo discriminante.

Tabla 3.8. Marca comercial y variedades de granos de maíz y rótulos correspondientes.

Marca

Hibrido

Rótulo

Sciences

DOW

508 PW

A1

Sciences

DOW

505 PW

A2

Monsanto

DK

7310 VF3P

B1

Monsanto

DK

7210 RRR

B2

Monsanto

DK

7010 VT3P

B3

Monsanto

DK

6610 VT3P

B4

Syngenta

SPS

2879 TD/T6

C1

Syngenta

SYN

960 TD/T6

C2

Syngenta

SY

900 VIPTENS

C3

Syngenta

SYN

960 TP/TG

C4

Syngenta

SY

140 TP/TG

C5

KWS

KM3601

MG/RR2

D1

KWS

KM4360

AS-G

D2

KWS

KM

3601 MC

D3

KWS

KM

4321 GL STOCK

D4

KWS

KM

4020 L

D5

KWS

KM

4500 GL STOCK

D6

KWS

KMA

4355 AS

D7

KWS

KM

4500 L

D8

KWS

KMA

35

D9

KWS

KM

4400 L

D10

KWS

KM

4020 GL STOCK

D11

KWS

KMA

4020 GL STOCK

D12

Pioneer

P

2069 H

E1

Pioneer

P

1845 YR

E2

Don Mario

DM

2771 VT3

F1

Don Mario

DM

2772 VT3

F2

Don Mario

DM

2773 VT3

F3

Don Mario

DM

2774 VT3

F4

Don Mario

DM

2775 VT3

F5

Don Mario

DM

2776 VT3

F6

Don Mario

DM

2777 VT3

F7

El modelo discriminante generó 5 ecuaciones lineales (funciones discriminantes, Tabla 3.9), que incluyeron a las variables seleccionadas y LDA realizó todas las combinaciones de variables y seleccionó la combinación que produjo una función discriminante con el menor error de clasificación. El LDA se aplicó a la matriz de datos para desarrollar un modelo que discrimine entre las 6 diferentes marcas de granos de maíz.

La significancia de las funciones se puede evaluar mediante el estadístico Lambda de Wilks (λ') calculada a partir de las correlaciones canónicas (método de análisis multivariado que busca relaciones lineales entre las variables) en conjunto con un valor de probabilidad (valor p).

Tabla 3.9. Funciones discriminantes mostrando su significancia mediante la función Lambda de Wilks y sus correspondientes valores de probabilidad.

Funciones

Lambda de

Wilks

GL*

Valor p

1

0,0253

35

0,0000

2

0,1810

24

0,0133

3

0,4293

15

0,1462

4

0,8024

8

0,7150

5

0,9898

3

0,9691

GL*: grados de libertad

Las dos primeras funciones discriminantes con valores p < 0.05 y con menores valores de Lambda de Wilks, indican que son estadísticamente significativas, con un nivel de confianza del 95% (Tabla 3.9). Por lo tanto, dos funciones discriminantes fueron necesarias para la partición completa de los datos.

En la Tabla 3.10 se muestran los coeficientes hallados para cada variable de las cinco funciones discriminantes obtenidas a través del LDA, de las cuáles, como ya se mencionó, solamente fueron utilizadas las dos primeras.

Tabla 3.10. Coeficientes de las funciones discriminantes obtenidas.

Funciones discriminantes

Variables

1

2

3

4

5

Cu

-0,6984

-0,0246

0,1580

0,6958

-0,6549

Mn

0,0816

-0,4336

-0,4382

0,3258

0,5191

Ni

23,4236

-22,9214

6,8425

-4,4923

-5,2712

Zn

0,0014

0,2644

0,1208

0,0132

0,1363

Ca

-0,1944

-0,1713

-0,1209

0,1422

-0,0564

Fe

0,1167

0,0758

0,022

0,1050

-0,0710

Mg

-0,0457

-0,0410

0,0823

0,0009

-0,0116

Constante

-7,6912

12,6393

-9,0761

-3,6829

1,1008

De esta manera, las funciones discriminantes que formarán parte del modelo de clasificación serán descriptas por las siguientes ecuaciones (ecuación 3.1):

F₁ = - 7.6912 - 0.6984 Cu + 0.0816 Mn + 23.4236 Ni + 0.0014 Zn - 0.1944 Ca + 0.1167 Fe - 0.0457 Mg

F₂= 12.6393 - 0.0246 Cu - 0.4336 Mn - 22.9214 Ni + 0.2644 Zn - 0.1713 Ca + 0.0758 Fe - 0.0410 Mg Ecuación 3.1.

De esta forma, las funciones de clasificación pudieron determinar a cuál de los 6 grupos puede pertenecer cada muestra de maíz. La Tabla 3.11 muestra los resultados de la clasificación luego de aplicar el modelo obtenido a través del LDA a la matriz de datos.

Para cada muestra, se calcularon los resultados para los casos que pertenecen a un grupo en particular. Las columnas muestran la frecuencia con la que se clasificó como pertenecientes a cada grupo y, por debajo entre paréntesis, se muestra el porcentaje de casos que clasificó correctamente.

Globalmente, el 81,25 % de las muestras clasificó correctamente en el conjunto de entrenamiento según su marca de pertenencia, por lo que el modelo multivariado obtenido, alcanzó una tasa de error global del 18,75%.

Utilizando los valores hallados mediante las dos funciones discriminantes, F1 y F2, fue posible obtener un gráfico de scores discriminantes (figura 3.9). El mismo es de gran ayuda en la visualización de la separación de los datos. Cada punto representa una muestra y, la disposición en el espacio bidimensional de la misma se calcula mediante las ecuaciones discriminantes. Es decir, cada muestra será definida por un par de coordenadas que definirán su localización en dicho espacio. Además, los scores están relacionados a las probabilidades de que una observación pertenezca o no a un grupo particular.

Tabla 3.11. Habilidad de clasificación del modelo LDA para los granos de maíz de acuerdo con la marca comercial.

Actual

Tamaño del grupo

Predicho

A

B

C

D

E

F

A

2

2

0

0

0

0

0

(100,00%)

(0,00%)

(0,00%)

(0,00%)

(0,00%)

(0,00%)

B

4

0

4

0

0

0

0

(0,00%)

(100,00%)

(0,00%)

(0,00%)

(0,00%)

(0,00%)

C

5

1

1

3

0

0

0

(20,00%)

(20,00%)

(60,00%)

(0,00%)

(0,00%)

(0,00%)

D

12

0

2

1

9

0

0

(0,00%)

(16,67%)

(8,33%)

(75,00%)

(0,00%)

(0,00%)

E

2

0

0

0

0

2

0

(0,00%)

(0,00%)

(0,00%)

(0,00%)

(100,00%)

(0,00%)

F

7

0

0

0

1

0

6

(0,00%)

(0,00%)

(0,00%)

(14,29%)

(0,00%)

(85,71%)

A través del gráfico de scores discriminante se pueden apreciar las agrupaciones de las diferentes muestras de maíz analizadas de acuerdo con la marca del grano. La primera función separa en general a todos los grupos, mientras que la segunda función explica mejor la discriminación entre los grupos E y F. Así mismo, ambas funciones ayudan a la separación de los grupos B y D. Es de importancia aclarar que los límites definidos para cada grupo están muy próximos entre sí e incluso solapados, en concordancia con los resultados obtenidos que se muestran en la tabla 3.11, donde se observa que algunas muestras que han sido mal clasificadas por el modelo.

Otro aspecto para considerar en las clasificaciones quimiométricas, es el número de muestras por grupo. Tal como se aprecia en la figura 3.9 y en tabla 3.11, los grupos A (Sciences) y E (Pionner), cuentan solamente con dos muestras cada uno, las cuales fueron las únicas asequibles a través del INTA.

Este bajo número de muestras para ambos grupos afecta significativamente el desempeño global del modelo, ya que se debería utilizar un número de muestras tal que sea representativa de la población a la cual pertenecen.

Figura 3.9 Gráfico de scores discriminante: distribución de las muestras de maíz en el espacio definido por las dos funciones discriminantes del LDA mostrando la clasificación según la marca comercial: Sciences (A). Monsanto (B). Syngenta (C).KWS (D). Pioneer (E) y Don Mario (F).

En aquellos casos, como el planteado, en donde el número de muestras es limitante, el ajuste relativo del modelo propuesto debe considerarse como una aproximación al modelo ideal. Esto implica qué en posteriores estudios, sería recomendable analizar mayor cantidad de muestras por marca para disminuir los errores en los modelos obtenidos.

Si bien este fenómeno afecta fuertemente a los modelos multivariados, siguen siendo una herramienta útil y eficaz para la evaluación de propiedades clasificatorias, aportando nuevo conocimiento acerca del tema, mostrando los beneficios y limitaciones de los métodos quimiométricos discriminantes.

3.2.3.2. Validación del modelo discriminante

La validación de un modelo discriminante se realiza mediante el uso de muestras adicionales pertenecientes a clases conocidas, que no forman parte del conjunto de entrenamiento original y son parte del conjunto de validación, a fin de comprobar la precisión, sensibilidad y selectividad del modelo. Una vez construido el modelo a partir del conjunto de entrenamiento, el conjunto de validación se utiliza para predecir la categoría a la que pertenecen nuevos objetos a partir de la medida de las variables predictoras. Sin embargo, cuando no se cuentan con suficiente cantidad de muestras, se puede recurrir a una validación interna.

En este análisis, se aplicó la validación interna cruzada, dejando una muestra afuera en cada iteración. La misma implica separar datos uno por uno de forma tal que para cada iteración se tenga un solo dato de prueba, mientras que el resto de los datos son utilizados para el entrenamiento y de esa forma, calcular el error como la raíz cuadrada media del error de validación [28]. Así, el modelo propuesto presentó un error de 19,3%, corroborando de esta manera los resultados de clasificación alcanzados en el conjunto de entrenamiento mostrado en la tabla 3.11.

3.3. Evaluación de prácticas agrícolas aplicadas en cultivos de maíz basada en la densidad de siembra y fertilización

Como se mencionó anteriormente en la sección 3.2, las plantas requieren de al menos 14 elementos minerales como nutrientes para su actividad fisiológica completa. Si estos nutrientes están fuera del rango óptimo de concentración, la planta mostrará síntomas de deficiencia o toxicidad que afectarán su supervivencia [6]. Previamente, se ha estudiado el efecto de metales en algunos cultivos, enfocándose en suelos contaminados, donde se observa la influencia de esos metales en el cultivo de la planta. De esta manera, existen trabajos publicados que determinan el contenido elemental en semillas de maíz cultivadas en suelos altamente contaminados [8][9]. Sin embargo, es escasa la información del perfil elemental en semillas de maíz de cultivos bajo otras condiciones de manejo, las cuales podrían ser útiles para maximizar los rendimientos de cultivo, tales como el efecto de la densidad de cultivos o el uso de fertilizantes en suelos normales.

Una gestión agrícola adecuada puede contribuir a la sostenibilidad de los sistemas de producción en el campo, ya que su práctica puede determinar tanto el tipo de explotación a realizar como la optimización de la producción de cultivos para permitir altos rendimientos y conservar la fertilidad del suelo. Para obtener el máximo rendimiento en condiciones ambientales normales, los cultivos deberían poder beneficiarse de la luz solar durante los períodos críticos de rendimiento.

El desarrollo de la planta de maíz está asociado con la capacidad de captar la luz solar. La práctica más efectiva para mejorar la captura de luz solar es optimizar la densidad del cultivo y el espaciado de las filas.

Un espacio entre hileras adecuado (densidad del cultivo) aumentan la intercepción de la luz incidente con el consiguiente aumento de la captura de luz por unidad de área foliar, aumentando las tasas de fotosíntesis y mejorando la disponibilidad de agua mediante la protección por evaporación del dosel [29]. Por otro lado, la fertilización afecta las características de calidad de las semillas de maíz cosechado debido a la disponibilidad de nitrógeno, fósforo y potasio en el suelo [30][31].

La disponibilidad de nutrientes del suelo limita la producción y el rendimiento del maíz; por lo tanto, es importante conocer las necesidades de la planta y la calidad del suelo en el que se desarrollará. Si esos requisitos no se proporcionan de manera natural, se pueden utilizar diferentes prácticas agrícolas para cubrir la deficiencia. La fertilización es una de las principales prácticas para mejorar el rendimiento de la tierra[22]. Aunque la fertilización con nitrógeno inorgánico solo o en combinación variable con nitrógeno orgánico (urea) no afecta el contenido de macronutrientes como P y K en semillas, una mayor proporción de N orgánico puede disminuir la absorción de micronutrientes por la planta [30]. Como consecuencia, es de esperarse cambios en el perfil mineral en los órganos y tejidos de las plantas, especialmente en las semillas.

El perfil mineral de los granos de maíz puede ayudar a inferir acerca de los efectos ambientales sobre la calidad del cultivo. Este análisis es importante para la evaluación de la absorción de nutrientes esenciales y no esenciales por parte de las plantas, cuya dinámica en el suelo es compleja [32]. Por otro lado, el análisis del material vegetal se puede utilizar como técnica de diagnóstico para determinar el estado nutricional de los cultivos, así como para proporcionar un control de calidad y/o índices de contaminación ambiental.

Además, el análisis multielemental puede proporcionar datos importantes sobre la calidad nutricional de los alimentos, ya que puede informar sobre elementos mayoritarios, minoritarios y tóxicos que pueden estar presentes en las semillas según el tipo de planta, la ubicación geográfica o las condiciones ambientales, basados en análisis un quimiométrico integral. De esta forma, y de acuerdo con nuestro conocimiento, no existen trabajos previos que estudien las prácticas agronómicas en maíz empleando perfil elemental y quimiometría.

3.3.1. Objetivo

Determinar diferencias entre las condiciones de los cultivos densidad de siembra y fertilización, mediante el análisis quimiométrico utilizando el análisis del perfil elemental de semillas de maíz recolectadas de diferentes lotes con distintas condiciones.

3.3.2. Condiciones de cultivo y muestreo.

Las muestras analizadas pertenecieron a:

Tres lotes con diferente densidad de cultivo: seis muestras con una densidad de siembra de 25.000 semillas/ha; tres muestras con una densidad de siembra de 35.000 semillas/ha y seis muestras con una densidad de siembra de 45.000 semillas/ha.

Dos lotes tratados con diferentes fertilizantes: doce muestras tratadas con fosfato de amonio (100 kg/ha) (PDA) y treinta y tres muestras tratadas con fosfato de amonio (100 kg/ha) combinadas con urea (140 kg/ha) (PDA- U).

Todas las muestras fueron recolectadas por triplicado.

3.3.3. Análisis Multielemental

El análisis multielemental se llevó a cabo mediante el uso de MPAES según lo descrito en 3.1.2 y el tratamiento de las muestras se realizó mediante digestión asistida por ultrasonidos según se detalla en 2.4.1.

La Tabla 3.12 muestra los resultados del análisis multielemental obtenido para lotes con diferentes densidades de cultivos. En términos generales no se observaron tendencias claras de aumento o disminución de la concentración elemental en el grano en función del aumento de la densidad de siembra, ya que cada elemento tuvo un comportamiento particular en cada caso.

Tabla 3.12. Contenido mineral de las semillas de maíz en las diferentes densidades de siembra estudiadas. Los valores de LOQ están incluidos en tabla 3.3.

Densidad de cultivo (semillas/ha)

Analito

25.000 a b

35.000 a b

45.000 a b

Ca

3,85

±

1,76

4,11

±

0,60

4,02

±

2,67

Cd

LOQ

LOQ

LOQ

Cr

0,59

±

0,20

0,55

±

0,01

0,53

±

0,08

Cu

2,38

±

0,32

LOQ

2,13

±

0,85

Fe

24,75

±

7,42

32,86

±

19,79

34,58

±

9,10

Mg

1049,63

±

248,77

1378,38

±

108,54

1074,77

±

231,31

Mn

7,15

±

1,36

4,40

±

0,51

7,80

±

1,40

Ni

3,95

±

0,16

3,24

±

0,14

4,09

±

0,35

P

3338,86

±

275,58

4097,02

±

179,95

5051,37

±

305,63

Pb

LOQ

LOQ

LOQ

Zn

19,76

±

2,17

13,83

±

1,44

22,25

±

2,67

a Concentración expresada en mg. kg⁻¹.

b Media ± SD (nA= 6; nB = 3; nC = 6).

3.3.4. Análisis de los Datos

Los modelos quimiométricos de clasificación para el estudio de la densidad de cultivos se desarrollaron utilizando como variables el contenido de P, Mg, Zn, Fe, Ca, Mn, Cr, Cu y Ni, mientras que para el estudio de fertilización las variables utilizadas fueron la concentración de Fe, Mg, Zn, Ca, Mn, Cr, Cu y Ni. Para el análisis de cluster, los criterios de amalgamación fueron el método Ward y la distancia Euclídea al cuadrado para la evaluación de la densidad del cultivo, mientras que la distancia de Manhattan fue utilizada para la fertilización con nitrógeno.

3.3.4.1. Efecto de las densidades de cultivos

El modelo de PCA se obtuvo utilizando 2 componentes principales (PC) que explicaron (según el porcentaje de varianza explicada) un 99% de la información original. La figura 3.10 muestra el modelo de PCA en el que se pueden observar tres grupos de muestras según el número de semillas por hectárea: A (25000 semillas / ha). B (35000 semillas / ha) y C (45000 semillas / ha). Además, la figura muestra la influencia de P en PC1, que es el principal responsable de generar los grupos sobre el CP1, mientras que el Mg posee gran influencia sobre el CP2.

Figura 3.10. Gráfico de scores (izquierda) para la discriminación según la densidad. A) 25.000; B) 35.000 y C) 45.000 semillas/ ha; Gráfico de loadings (derecha) muestra la influencia de las variables originales en el modelo.

Eso significa que el contenido de P jugó un papel relevante y mostró un efecto marcado en el sistema, lo que indica que este elemento resulta clave para explicar el comportamiento del modelo según la densidad del cultivo. Por su parte, el Mg también tuvo una marcada influencia en el modelo sobre la CP 2, siendo este elemento un componente esencial de la clorofila. La Figura 3.11 muestra el dendograma obtenido por CA (utilizando las mismas variables que PCA) para la diferenciación de lotes con diferentes densidades de semillas que confirman los resultados obtenidos por PCA, pero también se puede observar que la densidad de siembra más alta presenta diferencias marcadas en comparación con las densidades más bajas, las cuales se agrupan juntas dentro de un sub-cluster.

Figura 3.11. Dendograma obtenido por CA para lotes muestreados con diferentes densidades de semillas: A) 25.000; B) 35.000 y C) 45.000 semillas/ ha

3.3.4.2. Efecto de la aplicación de diferentes fertilizantes

La Tabla 3.13 muestra los resultados del análisis multielemental de los lotes tratados con los diferentes fertilizantes: fosfato de amonio (PDA) y fosfato de amonio + urea (PDA-U) donde la mayoría de los metales pesados medidos aumentaron con la aplicación de urea (excepto para Ni). Entre los nutrientes esenciales, Fe y Mg aumentaron aproximadamente el 100% bajo el tratamiento con PDA-U, mientras que Mn y Zn aumentaron en una proporción menor. Los elementos tóxicos Cd y Pb estuvieron por debajo del límite de cuantificación (<LOQ), mientras que el Cr pudo cuantificarse en PDA-U pero no en el tratamiento con PDA. Por otro lado, Ca y Cu no mostraron diferencias entre PDA y PDA-U.

Tabla 3.13. Contenido mineral de las semillas de maíz dependiendo el fertilizante aplicado. Los valores de LOQ están incluidos en tabla 3.3.

Fertilizante aplicado

Analito

PDA

PDA-U

Ca

5,30 ±  0,23

5,78 ± 0,60

Cd

LOQ

Cr

LOQ

0,53 ± 0,09

Cu

2,00 ± 0,86

1,87 ± 0,76

Fe

13,79 ± 4,28

28,79 ± 1,84

Mg

450,72 ± 55,97

1026,79 ± 201,65

Mn

5,21 ± 1,28

6,69 ± 1,27

Ni

4,62 ± 0,56

3,77 ± 0,34

P

4306,23 ± 525,68

4428,42 ± 586,21

Pb

                            < LOQ

Zn

15,89 ± 5,21

19,71 ± 3,01

Concentración expresada en µg/g.
b Media ± SD (nA= 6; nB = 3; nC = 6).

El modelo de PCA realizado para las muestras de maíz tratadas con fertilizantes permitió explicar el 97% de la información original a través de cuatro componentes principales. El gráfico de scores de PCA 3D (Figura 3.12) muestra dos grupos: A) suelo en el que solo se aplicó un fertilizante (fosfato de amonio, PDA) y B) suelo en el que se aplicaron dos fertilizantes combinados (fosfato de amonio y urea, PDA-U). En este caso, se utilizaron 8 elementos para construir el modelo de PCA (Mg, Cu, Ni, Zn, Ca, Fe, Cr y Mn, figura 3.12 a la derecha), de los cuales, Cu y Ni tuvieron más influencia en el tratamiento con PDA, mientras que Mg, Fe, Cr seguido de Zn, Mn y Ca fueron los elementos más influyentes en el grupo PDA-U.

Este modelo mostró que los elementos minoritarios, a diferencia con los resultados obtenidos en la densidad del cultivo, tuvieron una fuerte influencia en el agrupamiento, lo que indica un posible efecto sobre la composición enzimática en la planta, las cuales están constituidas por estos elementos.

El dendograma en la Figura 3.13 obtenido por análisis de cluster (CA) también permitió la confirmación del agrupamiento obtenido por el gráfico de scores. En este gráfico se observa una clara diferencia entre los dos tratamientos de fertilizantes, lo cual indica que el impacto en el perfil elemental de ambos tratamientos en el maíz produce efectos fisiológicos marcadamente diferentes. De esta manera, observando las figuras 3.12 y la tabla 3.13, se puede apreciar que el análisis de granos de maíz con tratamiento PDA-U, posee en términos generales, una mayor concentración elemental comparada con el tratamiento PDA.

Figura 3.12 Gráfico de scores (arriba) para la discriminación según diferentes fertilizantes. A) PDA; B) PDA-U; El gráfico de loadings (abajo) muestra la influencia de las variables en el modelo..

Figura 3.13 Dendograma obtenido por CA para los diferentes fertilizantes aplicados donde se observa el agrupamiento obtenido en PCA. .

Existe escasa información sobre el perfil mineral de las semillas cuando la densidad del cultivo es el factor evaluado. Bisht, Bhatnagar y Singh[30] reportaron una disminución del contenido de P en los granos de maíz a medida que la densidad de los cultivos aumenta de 63.000 plantas/ha a 100.000 plantas/ha. Sin embargo, las densidades de cultivos evaluadas en el presente trabajo mostraron un aumento en el contenido de P en las semillas de maíz cuando las densidades de cultivos son de 25.000 plantas/ha a 45.000 plantas/ha. Esto parece indicar que existen valores de densidad de cultivo en los que la acumulación de P en las semillas de maíz alcanza niveles máximos (como en este trabajo), pero luego disminuye a medida que la densidad del cultivo aumenta a 100.000 plantas/ha.

French, Seymour y Malik [33], establecieron una densidad de cultivo óptima para la canola en varias zonas australianas en función del rendimiento de grano o aceite de grano como parámetros indicativos de rendimiento. Informan que cuando esos parámetros medidos alcanzaron valores máximos, se mantuvieron constantes a una mayor densidad de cultivo. Esto sugiere que cuando los valores de densidad del cultivo superan los valores críticos, aunque el rendimiento puede no verse afectado, los cambios en el perfil mineral y la calidad de las semillas podrían verse comprometidos con este tipo de manejo.

El aumento de minerales mostrado en la tabla 3.13 según el tipo de fertilizante, puede deberse a la biodisponibilidad de los elementos minoritarios cuando la disminución del pH del suelo es inducida por la aplicación de urea. La urea puede acidificar el suelo dando como resultado la transformación de ciertos metales y aumentando su disponibilidad [34]. Aunque algunos elementos minoritarios se acumulan en las raíces, debido al pH, la biodisponibilidad de varios minerales aumenta, lo que permite su acumulación en otras partes de la planta [35] y semillas como es el caso de Cr [36].

Este hecho puede explicar el aumento del contenido de Cr, Fe, Mg, Mn y Zn en las muestras PDA-U; sin embargo, no puede explicar la disminución de Ni, cuya biodisponibilidad en el suelo también se vería afectada por el pH. El análisis de los resultados de PCA surge dos cuestiones para analizar: 1) la tendencia de la acumulación de metales pesados en las semillas cuando se aplica urea como fertilizante y 2) la disminución del contenido de Ni en las semillas por la misma razón. En el primer caso, como ya se mencionó, hay varios trabajos publicados que indican que la influencia de la urea en la acidificación del suelo [37][38] aumenta, en consecuencia, la disponibilidad de ciertos metales minoritarios [35][39].

Sin embargo, la reducción de la concentración de Ni en las semillas puede explicarse por su inclusión como grupo protésico en las enzimas ureasas de la comunidad microbiana del suelo [40], que a pesar de la acidificación del suelo por la urea puede hacer que el Ni esté más disponible, la síntesis microbiológica de la ureasa en el suelo, que es activado por la urea, podría capturar Ni reduciendo su disponibilidad para la planta y, en consecuencia, disminuir el contenido de Ni en la semilla[41].

3.4. Efecto de la topografía en el perfil elemental de granos de maíz. Aplicación quimiometrica

La condición topográfica del área donde se desarrolla el cultivo (es decir, terrenos con pendientes, más conocidos como lomas y bajos) es un factor importante debido a que se produce la lixiviación de minerales desde las lomas (mayor pendiente) hacia los bajos (menor pendiente), lo que genera mejores condiciones para el crecimiento de las plantas en áreas bajas [4][42][44]. Como consecuencia, las plantas que se encuentran en zonas más bajas verán favorecido su crecimiento, debido a que tienen mayor disponibilidad de agua y nutrientes. Por este motivo, se puede encontrar una marcada diferencia en los rendimientos de maíz que crecen en lomas y bajos debido a la lixiviación y escorrentía que pueden ocasionar la acumulación de nutrientes esenciales, pero también de elementos tóxicos. Este transporte de metales en el suelo está determinado por varios factores, como la concentración de metal en el suelo, la textura (composición de arena. limo y arcillas), la pendiente del terreno y la intensidad de las precipitaciones [45].

Los efectos a corto plazo pueden evaluarse con mayor precisión teniendo en cuenta las concentraciones de metal disuelto en la solución del suelo, pero los cambios causados por la composición elemental en la planta son de mayor relevancia considerando su influencia biológica a largo plazo[46].

Las variaciones del contenido de agua en el suelo pueden tener una gran influencia en la absorción de nutrientes. El efecto del bajo contenido de agua en las lomas puede limitar la disponibilidad de nutrientes y disminuir el crecimiento de raíces [47]. En este contexto, dos alternativas pueden afectar la movilidad de los nutrientes y su disponibilidad, que están estrechamente relacionadas con el contenido de agua:

Cuando el contenido de agua disminuye, la movilidad de los iones también disminuye porque el aire reemplaza los espacios de agua en los poros delimitados por las partículas del suelo, lo que puede determinar la inmovilización de algunos elementos en la fase sólida del suelo[3].

La absorción y acumulación de elementos mayoritarios y minoritarios en las plantas depende del transporte desde la solución del suelo a las raíces, así como de su translocación desde la raíz a los tallos, hojas y tejidos de almacenamiento de la planta (como semillas, granos o frutas) que también están relacionados con la disponibilidad de agua [4][7].

Se han realizado varios estudios sobre el efecto de los metales en los cultivos, evaluando la influencia de estos elementos en el crecimiento de las plantas. Por ejemplo, en el caso del trigo, se ha estudiado el perfil elemental para diferenciar los cultivares [48][50] y para evaluar el efecto de los fertilizantes sobre la concentración elemental en los granos [49][51][53].

Además, se ha demostrado que los efectos combinados, incluidos los cultivares, el uso de fertilizantes, las condiciones geográficas y el tiempo de siembra, afectan la búsqueda elemental de huellas dactilares en los granos de trigo [54].

Como se ha mencionado con anterioridad, la calidad nutricional del grano de maíz indica y predice la calidad del cultivo [52][55]; por lo tanto, evaluar el perfil elemental es importante para poder encontrar características nutricionales basadas en la composición, así como los posibles modelos de clasificación. Según la bibliografía, los métodos quimiométricos basados en el análisis elemental han revelado diferencias dentro del conjunto original de datos y han permitido clasificar granos de maíz de acuerdo con los parámetros de calidad de los alimentos tales como ácidos grasos, compuestos fenólicos, pigmentos, contenido de elementos de transición [56], dureza del grano [57] y año de siembra [58]. Además, como ya se ha mencionado, se han informado otros estudios de determinación elemental sobre granos, vinculados a suelos contaminados [9].

3.4.1. Objetivo

Establecer relaciones entre la calidad del grano y las condiciones topográficas para el crecimiento del cultivo (loma y bajo), utilizando como datos la determinación de la composición elemental de las semillas de maíz.

3.4.2. Análisis Multielemental

Para evitar influencias varietales, se tomaron muestras de la misma variedad de granos de maíz. Se analizaron muestras de 12 sitios: 6 muestras de lomas y 6 muestras de bajos, todas por triplicado. La diferencia de altura entre lomas y bajos fue de entre 3 a 15 metros.

El análisis multielemental se llevó a cabo mediante el uso de MPAES según lo descrito en 3.1.2 y el tratamiento de las muestras se realizó mediante digestión asistida por ultrasonidos según se detalla en 2.4.1.

La Tabla 3.14 muestra los resultados de la determinación multielemental en muestras de maíz de diferentes topografías: loma y bajo; se puede observar la ausencia de Cd y baja concentración de Pb (debajo del LOQ). Según prueba t, el contenido de Mg fue significativamente mayor en los granos de los bajos, pero se encontraron concentraciones similares en el resto de los elementos para ambas topologías.

Tabla 3.14. Determinación multielemental en muestras de granos de maíz.

Analito a.b

Loma

Bajo

Ca

3,63 ± 0,99

3,51 ± 0,44

Cd

ND

ND

Cr

< LOQ

0,52 ± 0,17

Cu

2,21 ± 0,43

2,15 ± 0,16

Fe

14,88 ± 2,54

15,37 ± 2,57

Mg

592,01 ± 116,65

807,33 ± 103,56

Mn

5,99 ± 0,56

5,27 ± 0,99

Ni

4,39 ± 0,93

4,99 ± 0,60

Pb

<LOQ

<LOQ

Zn

13,83 ± 3,84

14,97 ± 4,45

aConcentración expresada en mg. kg⁻¹.
bMedia ± SD (nA= nB = 6).

3.4.3. Análisis Quimiométrico

Se utilizaron como herramientas quimiométricas el análisis de componentes principales (PCA), análisis de cluster (CA) y análisis de discriminante lineal (LDA) para caracterizar los granos de maíz que pertenecían a diferentes topografías.

El modelo de PCA se obtuvo utilizando como variables la concentración de 8 elementos (Ca, Cr, Cu, Fe, Mg, Mn, Ni y Zn): cuatro componentes principales explicaron el 94% de la información original, con un error cuadrático medio de predicción (RMSP) de 0,27. La Figura 3.14 (gráfico de scores) muestra dos grupos bien diferenciados según los dos casos: lomas (A) y bajos (B). La Figura 3.15 (loadings) muestra que Mg, Cr y Fe tuvieron mayor influencia en el agrupamiento de muestras de maíz pertenecientes a los bajos; en otras palabras, las muestras de semillas de maíz de los bajos mostraron niveles más altos de Cr, Mg que las muestras de las lomas. Por el contrario, las muestras procedentes de las lomas estuvieron influenciadas por la concentración de Mn y Cu.

Figura 3.14 Gráfico scores donde se observa el efecto de la topografía: en color rojo las muestras de la loma (A) y en azul las muestras del bajo (B).

Figura 3.15 Gráfico de loadings de PCA donde se muestran la influencia de las variables originales en el modelo obtenido.

La Figura 3.16 muestra el dendograma obtenido por CA para la agrupación de semillas de maíz dependiendo la topografía, utilizando las mismas variables que PCA.

Las muestras se agruparon nuevamente en dos, usando el método Ward como criterio de agrupamiento y la distancia Euclídea al cuadrado como criterio de distancia, confirmando los resultados obtenidos por PCA.

Figura 3.16 Agrupamiento obtenido por CA para las semillas de maíz dependiendo la topografía (loma-bajo).

Finalmente, se realizó el análisis discriminante lineal (LDA) utilizando las mismas 8 variables que PCA y CA, mostrándose la clasificación obtenida en la Tabla 3.15, utilizando 4 muestras para entrenamiento y 2 muestras para conjuntos de predicción.

Tabla 3.15 Tabla de confusión. LDA realizado en muestras.

Entrenamiento

Bajo

Loma

Total

Error (%)

Bajo

4

0

4

0

Loma

0

4

4

0

Predicción

Bajo

Loma

Total

Error (%)

Bajo

2

0

2

0

Loma

0

2

2

0

De acuerdo con la prueba t, no se observaron diferencias significativas entre los elementos analizados, excepto para Mg. Como ya se mencionó, estas diferencias en el contenido de Mg podrían deberse a la acumulación de nutrientes y minerales en los bajos por escorrentía en suelos con pendiente[59] . Existen varios trabajos que describen cómo los terrenos irregulares afectan la composición mineral de los suelos[60][63] . Por esta razón, algunos metales están más disponibles en las zonas con menor pendiente que en zonas de mayor pendiente [54]. El mayor contenido de Cr y Mg en las semillas de maíz recolectadas en el bajo podría indicar un efecto de acumulación en el grano de maíz por efecto de la lixiviación y escorrentía. La absorción de ciertos elementos de la planta de la solución del suelo puede deberse a diversos factores como el ambiente, la temperatura, el pH, la aireación, la conductividad eléctrica, la competencia entre especies, el tipo de planta, el tamaño de la planta, el sistema radicular, la disponibilidad de elementos, el tipo de hoja y contenido de humedad del suelo y de la planta [64].

Los metales pueden estar presentes en el suelo como componentes naturales o como consecuencia de actividades antropogénicas. La concentración de metales de origen natural (geogénico) dependerá de su geodisponibilidad, es decir, la cantidad de metal que se puede liberar de la roca madre a través de procesos mecánicos, químicos o biológicos [65]. La movilidad de los oligoelementos en los suelos es importante en términos de biodisponibilidad ya sea de origen natural o antropogénico [66]. En este trabajo, podemos suponer que el origen principal de Cr en el suelo proviene de fuentes naturales, debido a que en la región no existen evidencias de contaminación antropogénica con metales.

Esto significa que se espera que los valores de concentración de los metales en estos suelos sean bajos, propios de suelos no contaminados, debido a la baja densidad de población, así como una baja actividad minera e industrial en la región [67]. Existen evidencias de que el Cr puede incorporarse al maíz con la aplicación de algunos suplementos en suelos como el fosfato y el hierro, mejorando la captura de Cr por parte de las plantas [68]; sin embargo, este efecto dependerá en gran medida del tipo y la calidad de los fertilizantes usados. Dado que el área muestreada es una región agrícola, por consiguiente, con menos de 750 mg. kg⁻¹ de Cr según el valor establecido por la Ley 24051 [69], es evidente que el contenido de Cr en los suelos de los bajos del área seleccionada fue suficiente para acumular Cr en las semillas de maíz que marcan una diferencia significativa de las plantas que crecen en las lomas. Además, el Cr en los suelos de los bajos estudiados podría considerarse como Cr altamente biodisponible, aunque el contenido de Cr encontrado en las semillas fue inferior al máximo permitido según la OMS [70] (2 mg kg-1) siendo adecuado para el forraje o el consumo directo en humanos. En las plantas, el mayor contenido de Cr se encuentra en las raíces, luego en las hojas y los tallos, mientras que la concentración más baja se encuentra en los granos[71][72]. La presencia de Cr en las semillas de maíz, aunque con bajas concentraciones, podría ser un indicador de que en el resto de la planta (raíz, tallo y hojas) esta concentración podría ser mayor. Esto fue confirmado en esta tesis, en el próximo apartado (3.5), donde la concentración de Cr en hoja fue casi 10 veces superior a la hallada en semilla.

Otro aspecto para considerar es la presencia de Cr en las semillas como factor de crecimiento, ya que se considera un nutriente no esencial en las plantas [73]. Sin embargo, varios trabajos han demostrado que las pequeñas adiciones de Cr tienen efectos estimulantes sobre el crecimiento y la productividad de las plantas [74][75]. También se han observado efectos beneficiosos, como los antimicóticos y la estimulación del crecimiento en plantas cultivadas en el suelo o en soluciones que contienen Cr [76][76]. Las cantidades de Cr que se encuentran en las semillas de maíz podrían ser beneficiosas para el desarrollo inicial de las plantas de maíz; aunque se deben realizar más estudios con respecto a la correspondencia entre el contenido de Cr en las semillas y los parámetros de desarrollo de la planta.

En el caso del Mg, este macronutriente es esencial para el crecimiento de la planta y su posterior desarrollo porque es el metal central en la molécula de clorofila [77]. Una disminución de Mg en el suelo puede producir una reducción en la disponibilidad de este elemento en la planta y, como consecuencia, causará una disminución en el rendimiento. La mayor concentración de Mg se encontró en las muestras de los bajos, por lo que es más apto para el desarrollo de los cultivos que las lomas. En el caso del Mg, su presencia puede proceder tanto de fuentes naturales como antropogénicas. En la provincia de La Pampa, los suelos son ricos en Ca y Mg, debido a la presencia de una capa de piedra caliza (tosca) cerca de la superficie: dependiendo de las condiciones del suelo, como el pH, la humedad y las lluvias, esta capa puede proporcionar Mg y luego acumularse en los bajos. Pero también, el Mg se usa frecuentemente como regulador del pH de los suelos o incluso, puede incorporarse indirectamente con fertilizantes como NPK (nitrógeno, fósforo y potasio). Por estas razones, el Mg puede tener un origen antropogénico significativo debido a las prácticas agrícolas. Luego, con la lluvia, el Mg puede lixiviar desde las lomas y acumularse en los bajos y estar disponible para las plantas. Para esto, la incorporación localizada de Mg en las lomas podría ser una práctica recomendada para mejorar la disponibilidad de este elemento para las plantas cultivadas en esos lugares.

Por último, los resultados obtenidos por LDA (Tabla 3.15) muestran que los granos de maíz de las lomas y los bajos son significativamente diferentes en los conjuntos de entrenamiento y predicción, lo que confirma el análisis realizado por PCA y CA por un método quimiométrico supervisado, con un 100% de clasificación correcta, en la que la influencia combinada de Cr y Mg produjo dicha clasificación. Eso indica que el crecimiento de las plantas en los bajos puede favorecerse en comparación con las plantas que crecen en las lomas, debido a la presencia de nutrientes, como los elementos estudiados, que tienen una influencia directa en el rendimiento.

3.5. Análisis multielemental en material foliar y semillas de maiz por mpaes y posterior estudio quimiometrico: aplicación elementómica

En la actualidad, es cada vez más importante realizar el análisis elemental de los diferentes tejidos de los cultivos para poder evaluar la concentración de éstos en las diferentes partes de la planta, y así poder contar con una técnica diagnóstica del estado nutricional.

El término “análisis foliar” incluye todos aquellos métodos de diagnóstico directo que hacen uso del análisis químico aplicado a partes representativas de las plantas [78].

Si se desea enfocar el análisis foliar desde el punto de vista de balance nutricional de la planta, una adecuada selección de muestras puede incluir, la planta entera o secciones específicas de la misma, como las hojas, las cuales son las que mejor reflejan el estado nutricional de la planta, ya que es ahí donde se efectúa la elaboración de las sustancias para el crecimiento y la fructificación. Es importante mencionar que el análisis foliar generalmente se complementa con un estudio de la fertilidad y de las propiedades del suelo [79]. La realización de un análisis de suelos complementario al análisis foliar es de mucha importancia, ya que se espera que exista una relación directa entre la proporción existente de los contenidos nutricionales en el suelo y en las hojas y la razón entre dichos contenidos y el rendimiento de la planta [80]. Como consecuencia de la contaminación de los suelos, del aire, de las aguas e incluso como producto de fumigaciones y fertilizaciones directas, es posible que se produzca la acumulación de elementos tóxicos en los tejidos de las plantas, de ahí la importancia de llevar a cabo análisis foliares para evaluar la concentración de estos. De esta manera, el análisis foliar también es empleado como práctica preventiva, además de ser utilizado como índice de contaminación ambiental y como técnica de control de calidad de plantas.

Por su parte, la elementómica se define como la cuantificación de elementos en sistemas biológicos, así como la distribución y especiación de tales elementos y las reacciones biológicas en la que intervienen. Por ello, en esta sección se abordará un estudio elementómico integral en hoja y grano de maíz, a través de la interpretación y análisis de datos multielementales realizados a través de quimiometría.

3.5.1. Objetivo

Realizar el análisis multielemental de muestras de hojas de maíz correspondientes a dos tecnologías hibridas comerciales diferentes y aplicar el análisis quimiométrico con el fin de clasificar las muestras de hojas según el tipo de tecnología, así como llevar a cabo un estudio elementómico basado en la interpretación de datos de concentración elemental realizadas en hojas y granos de maíz pertenecientes a dos tecnologías híbridas diferentes.

3.5.2. Análisis Multielemental en Hojas

El análisis multielemental se llevó a cabo mediante el uso de MPAES según lo descrito en 3.1.2 y el tratamiento de las muestras se realizó mediante horno microondas según se detalla en 2.5. Se determinaron los siguientes analitos: Al, Ba, Cd, Cr, Cu, Fe, Mn, P, Pb, Sr y Zn. En la tabla 3.16 se observan las cifras de méritos obtenidas en MPAES. La Tabla 3.17 muestra los resultados obtenidos (medias generales) del análisis multielemental para 20 muestras de hojas de maíz correspondientes a dos tecnologías hibridas diferentes: 10 muestras de diferentes híbridos con tecnología de semilla Syngenta y 10 muestras de diferentes híbridos con tecnología de semilla Monsanto.

Tabla 3.16. Cifras de mérito obtenidas en muestras de hojas de maíz.

Elemento

LOD

[mg. kg⁻¹]

LOQ

[mg. kg⁻¹]

Al

1,10

3,33

Ba

10,07

30,53

Cd

1,49

4,53

Cr

2,88

8,73

Cu

1,34

4,07

Fe

82,72

250,65

Mn

1,17

3,55

P

108,13

327,66

Pb

25,87

77,57

Sr

4,18

12,67

Zn

1,59

4,82

Tabla 3.17.Concentraciones promedio de las muestras de hojas de maíz analizadas por MPAES.

Monsanto a-b

Syngenta a-b

Al

764 ± 370

764 ± 394

Ba

28,2 ± 5,8

28,7 ± 5,9

Cd

ND

ND

Cr

5,4 ± 1,3

3,08 ± 1,4

Cu

19,1 ± 6,9

10,1 ± 2,4

Fe

712 ± 169

676 ± 105

Mn

108 ± 39

125 ± 2

P

< LOQ

< LOQ

Pb

ND

ND

Sr

137 ± 19

193 ± 34

Zn

23,2 ± 4,1

27,1 ±5,4

Concentración expresada en mg. kg⁻¹.
b Media ± SD (nM= nS = 10).

Como se puede observar en la tabla 3.17, no se ha detectado la presencia de elementos tóxicos como Cd y Pb, los cuales pueden influir en el crecimiento y desarrollo de la planta afectando el rendimiento del cultivo de maíz. La aplicación de una prueba t, demostró que los contenidos hallados de Cr y Cu fueron significativamente mayores en la tecnología Monsanto en comparación Syngenta, mientras que el contenido de Sr y Zn en esta última fue mayor que en Monsanto. El resto de los analitos cuantificados en las hojas no tuvieron diferencias significativas entre ambas marcas.

3.5.3. Análisis Quimiométrico de Hojas

Se utilizaron como herramientas quimiométricas el análisis de componentes principales (PCA) y análisis de discriminante lineal (LDA) para caracterizar las hojas de maíz que pertenecían a diferentes tecnologías de origen. El modelo de PCA se obtuvo utilizando como variables originales, las concentraciones de Al, Ba, Cr, Cu, Fe, Sr y Zn: cuatro componentes principales explicaron el 92% de la información original, con un error cuadrado medio de predicción (RMSP) de 0.23.

La Figura 3.17 (gráfico de scores) muestra dos grupos bien diferenciados según la tecnología de origen: Monsanto y Syngenta. La Figura 3.18 (loadings) muestra que Cr y Cu tuvieron mayor influencia en el agrupamiento de muestras de hojas pertenecientes a la tecnología Monsanto, ya que ésas muestras de hojas de maíz mostraron niveles más elevados de Cr y Cu, que aquellas pertenecientes a tecnología Syngenta. Por el contrario, las muestras de hojas de la marca Syngenta estuvieron influenciadas por la concentración de Sr y Zn.

Figura 3.17 Gráfico scores donde se observan los dos grupos definidos por la marca comercial: Syngenta (verde) y Monsanto (azul).

Figura 3.18 Gráfico de loadings de PCA donde se muestran la influencia de las variables originales en el modelo obtenido..

Posteriormente, se realizó el análisis discriminante lineal (LDA) utilizando las mismas variables que PCA, mostrando la clasificación obtenida en la Tabla 3.18, en el cual se utilizaron 6 muestras para entrenamiento y 4 muestras para el conjunto de predicción. Los resultados obtenidos por LDA muestran que las hojas de maíz Monsanto y Syngenta son significativamente diferentes en los conjuntos de entrenamiento y predicción, lo que confirma el análisis realizado por PCA por un método quimiométrico supervisado, con un 100% de clasificación correcta.

Tabla 3.18 Tabla de confusión. LDA realizado en muestras de hojas.

Entrenamiento

Monsanto

Syngenta

Total

Error (%)

Monsanto

6

0

6

0

Syngenta

0

6

6

0

Predicción

Monsanto

Syngenta

Total

Error (%)

Monsanto

4

0

4

0

Syngenta

0

4

4

0

A partir de los resultados obtenidos, se puede apreciar que el análisis de los diferentes tejidos de maíz es capaz de brindar información relevante acerca de la planta. En el caso particular del análisis elemental en tejido foliar de maíz, que es complementario a los análisis previamente realizados en semillas, permitió distinguir con claridad dos tipos de tecnologías empleadas para el desarrollo de semillas híbridas: tanto Monsanto como Syngenta emplean distintas tecnologías que incluyen desarrollo de híbridos genéticos que se encuentran fuertemente resguardados a través de patentes.

A pesar de ello, si bien no es posible conocer con detalle qué tipo de modificaciones son realizadas en la planta para obtener las semillas hibridas, desde el punto de vista quimiométrico, resulta importante poder observar las marcadas diferencias entre tecnologías, con el propósito de poder distinguirlas como parte de un sistema de control de calidad de estas. En consecuencia, el estudio multielemental en tejido foliar resulta un análisis complementario específico al desarrollado anteriormente en 3.2. En aquél ítem, el análisis se desarrolló en semillas y permitió la clasificación de las marcas que se comercializan en el país. Sin embargo, en este apartado, el análisis del material foliar y posterior análisis de semillas expresa, en este caso, una información totalmente distinta al ítem 3.2, relacionada a diferencias genéticas entre los dos tipos de maíces híbridos.

3.5.4. Análisis Multielemental de Semillas de Maíz Correspondientes a las dos Tecnologías Hibridas

Debido a los resultados obtenidos previamente en 3.5.2 y 3.5.3., se decidió realizar el análisis multielemental de semillas de maíz, correspondientes a las dos tecnologías hibridas realizadas para hojas. Se analizaron las mismas muestras de plantas según lo descripto en: 3.5.2; un total de 20 muestras de semillas de maíz: 10 pertenecientes a tecnología de semilla Syngenta y 10 muestras con tecnología de semilla Monsanto.

La Tabla 3.19 muestra los resultados obtenidos (medias generales) del análisis multielemental para las 20 muestras de semillas de maíz. Utilizando prueba t, se halló que el contenido encontrado para Cu, Mn y Zn fue mayor en semillas de tecnología Monsanto que en semillas de tecnología Syngenta. Al, Ba, Sr, Pb y Cd no fueron detectados o bien, estuvieron por debajo del límite de cuantificación. Para el resto de los minerales no se encontraron diferencias significativas entre tecnologías.

Tabla 3.19. Concentraciones promedio de las muestras de semillas de maíz analizadas por MPAES.

Monsanto a-b

Syngenta a-b

Al

< LOQ

< LOQ

Ba

< LOQ

< LOQ

Cd

ND

ND

Cr

0,42

±

0,06

0,43

±

0,08

Cu

2,61

±

0,52

1,93

±

0,39

Fe

10,27

±

2,21

14,41

±

2,52

Mn

6,18

±

1,11

4,78

±

1,03

P

4696

±

1140

4516

±

1040

Pb

ND

ND

Sr

ND

ND

Zn

17,95

± 2,06

14,53

± 2,25

aConcentración expresada en mg. kg⁻¹.
bMedia ± SD (nM= nS = 10).

En cuanto al contenido de P en las hojas, tal como se informó en la sección 3.5.2 (tabla 3.17) los resultados indicaron que se encontraba por debajo del límite de cuantificación; en cambio como podemos observar en la tabla 3.19 la semilla de maíz ha manifestado un alto contenido de este macronutriente. Este resultado es consistente con una translocación total de este nutriente a la semilla.

3.5.5. Análisis Quimiométrico de Semillas

Al igual que en las hojas, se utilizaron como herramientas quimiométricas el análisis de componentes principales (PCA) y análisis de discriminante lineal (LDA) para caracterizar las semillas de maíz que pertenecían a diferentes tecnologías de origen.

El modelo de PCA para semillas se obtuvo utilizando como variables la concentración de cinco elementos: Cr, Cu, Fe, Mn y Zn. Cuatro componentes principales explicaron el 93% de la información original con una predicción cuadrática media baja (RMSP) cuyo valor fue de 0,22. La Figura 3.19 (gráfico de scores) muestra, al igual que en 3.5.3, dos grupos bien diferenciados según la tecnología de origen: Monsanto y Syngenta.

La Figura 3.20 (loadings) muestra la influencia de las variables Cu, Mn y Zn en el agrupamiento de muestras de semillas pertenecientes a la marca Monsanto; mientras que las semillas de tecnología Syngenta se agrupan por influencia de las variables Cr y Fe.

Figura 3.19 Gráfico scores donde se observan los dos grupos definidos por la marca comercial: Syngenta (verde) y Monsanto (azul)

Figura 3.20 Gráfico de loadings de PCA donde se muestran la influencia de las variables originales en el modelo obtenido.

Al igual que en las hojas, se realizó el análisis discriminante lineal (LDA) utilizando las mismas variables que PCA, mostrando la clasificación obtenida en la Tabla 3.20, en el cual se procedió de la misma forma que en hojas: 6 muestras para entrenamiento y 4 muestras para el conjunto de predicción. Los resultados obtenidos por LDA muestran que las semillas de maíz Monsanto y Syngenta son significativamente diferentes en los conjuntos de entrenamiento y predicción, confirmando lo obtenido en hojas.

Tabla 3.20 Tabla de confusión. LDA realizado en muestras de semillas.

Entrenamiento

Monsanto

Syngenta

Total

Error (%)

Monsanto

6

0

6

0

Syngenta

0

6

6

0

Predicción

Monsanto

Syngenta

Total

Error (%)

Monsanto

4

0

4

0

Syngenta

0

4

4

0

3.5.6. Análisis Elementómico de Maíz para el Estudio de Tecnologías Híbridas

La comparación del contenido de elementos en diferentes partes de las plantas es un índice del estado de los nutrientes y da una idea aproximada de la acumulación diferencial y el transporte de minerales a través de los diferentes tejidos vegetales.

Este enfoque nos permite determinar qué elementos se retienen en los tejidos de las plantas y qué elementos se transportan a las semillas cuando las plantas están cerca del final de su ciclo de crecimiento, período en que los nutrientes minerales se traslocan para el llenado del grano. Desde esta perspectiva, el elemento con el comportamiento más claro fue el fósforo, ya que es un macronutriente que se espera encontrar en grandes cantidades en todos los tejidos de la planta. Sin embargo, los resultados obtenidos indican una alta acumulación de P en las semillas de maíz, mientras que en las hojas su concentración estuvo debajo del LOQ. El transporte de fósforo para llenar las semillas al final del ciclo de vida de las plantas anuales es habitual tanto para el maíz [81], como para otras especies como arroz [82], el trigo [83][84], trigo duro [85] y muchos otros. Esto constituye una referencia para el análisis de otros elementos y su acumulación en semillas durante la etapa de llenado de semillas.

En oposición a P, los llamados elementos antinutrientes como Al, Ba y Sr están presentes en las hojas, pero no en las semillas. Esto sugiere que estos elementos se retienen en las hojas y no se trasladan a las semillas al final del crecimiento del maíz. Esto fue corroborado por Anjum [86] que informa pequeñas cantidades de Al en la etapa previa a la maduración de los granos de maíz, en comparación con las raíces, el tallo y las hojas. Con respecto a Ba y Sr, existen escasas referencias vinculadas a la translocación de estos elementos: en ciertos vegetales se absorben y movilizan a través de las plantas [87][88] y se acumulan en las semillas de algunas especies como la amapola [89], la vid [90] y trigo [54].

Teniendo en cuenta estos elementos como referencia para minerales translocados (es decir, P) y no translocados (es decir, Al, Ba y Sr), los resultados sugieren que Cr, Cu, Fe y Mn están más retenidos en las hojas; mientras que Zn en mayor proporción en semillas. Estos resultados son consistentes con los encontrados por Zang et.al [91] que informaron un bajo porcentaje del total de Cu, Fe y Mn en semillas de maíz, en comparación con las hojas, a diferencia del Zn, que muestra un mayor porcentaje en los granos.

Con relación a aquellos elementos que se transportan totalmente a la semilla (como P) o que no se transportan a la semilla (como Al, Ba, Sr), Monsanto y Syngenta no tuvieron diferencias, lo que sugiere que no hay diferencias entre los mecanismos bioquímicos de translocación para esos elementos en ambas tecnologías.

A pesar de que este enfoque no es habitual en la literatura, en esta sección de utilizó la estadística multivariada, a fin de realizar un estudio elementómico para diferenciar dos desarrolladores tecnológicos de semillas hibridas de maíz. Hasta 2015, había un total de seis grandes empresas transnacionales que investigaban y desarrollaban tecnologías de semillas (I+D) y comercializaban sus productos en todo el mundo: BASF, Bayer, Dow, DuPont, Monsanto y Syngenta [92]. Esta situación cambia entre 2015 y 2018 con la fusión de Dow y DuPont, la adquisición de Monsanto por parte de Bayer y la adquisición de Syngenta por parte de ChemChina, lo que reduce a cuatro las principales grandes empresas transnacionales de I+D [93]. Dentro de los seis grandes grupos iniciales, actualmente convertidos en cuatro, se recolectaron hojas y semillas de variedades de maíz de dos de estas tecnologías y se alcanzaron buenos modelos de clasificación. En relación con las tecnologías restantes, no pudieron ser analizadas debido a la imposibilidad de obtener muestras vegetales de las mismas.

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CAPÍTULO 4. CONCLUSIONES

4.1. Del pretratamiento de muestras

Las muestras de maíz se mineralizaron adecuadamente mediante un tratamiento asistido por ultrasonidos, lo que permitió la introducción de la muestra al sistema convencional de MPAES.

El método de preparación de muestras propuesto es una alternativa simple y rápida de utilizar para la determinación de Ag, Al, Ba, Be, Ca, Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Mg, Mn, Mo, Ni, P, Pb, Tl, V y Zn por MPAES, en muestras de granos de maíz. La cuantificación fue validada mediante uso de MRC así como adición de patrón.

Esta preparación de muestras podría ser una alternativa atractiva para el análisis de rutina, considerando principalmente las capacidades de análisis multielemental de MPAES para matrices complejas con alto contenido de carbono. Además, esta técnica disminuyó el tiempo de extracción de los analitos, lo que lo hace recomendable para el análisis de control de calidad de rutina para laboratorios que deben realizar una gran cantidad de análisis por día, en menor tiempo y a menor costo si se lo compara con un sistema de horno microondas convencional.

4.2. De la clasificación de maiz según marcas comerciales

Las concentraciones elementales presentes en las muestras de maíz son una fuente de información que puede ser utilizada para propósitos de clasificación.

En los últimos años, el uso de herramientas multivariadas ha demostrado tener una gran capacidad para el tratamiento de datos de gran volumen y difícil interpretación.

Se demostró que esta premisa se sigue cumpliendo aún en sistemas biológicos con matrices orgánicas complejas, como en el caso del grano de maíz.

A partir del modelo multivariado obtenido a través del análisis de discriminante lineal (LDA), fue posible clasificar las diferentes marcas de maíz, basado en el análisis de su perfil elemental con un alto porcentaje de clasificaciones correctas. Esto resulta sumamente útil para detectar posibles fraudes en la comercialización de granos para siembra. Asimismo, se debe poner especial atención en el diseño de muestreo a fin de obtener una cantidad de muestras suficientemente elevada para cumplir con la premisa de representatividad. Sin embargo, y a pesar de esta limitación, el modelo obtenido tuvo un buen desempeño, con errores aceptables considerando el grado de complejidad del análisis realizado.

Por todo lo expuesto, la metodología propuesta resulta económica y rápida (en comparación a otras técnicas instrumentales), lo cual permite su implementación en laboratorios de control de calidad de materias primas, así como de organismos oficiales.

4.3. DEL MANEJO AGRONOMICO

Existe una estrecha relación entre la calidad de la semilla y el contenido de nutrientes que influyen en el rendimiento del cultivo. Esto se debe a que las reservas de nutrientes de la semilla representan un factor clave que afecta la germinación y la uniformidad de las plantas en el campo y, como consecuencia, el rendimiento.

En este trabajo, el análisis de componentes principales y el análisis de clusters permitieron la discriminación de cada tipo de cultivo en relación con el tipo de fertilizante aplicado y con la diferente densidad en cultivos, en función del perfil mineral. Además, el análisis integral del perfil mineral realizado a través del análisis multivariado permitió determinar las diferencias entre las prácticas de manejo agrícola y sus posibles efectos en la calidad de la semilla.

El estado eco-fisiológico esperado de las plantas para una producción de maíz más adecuada y eficiente es fundamental para tomar decisiones sobre las prácticas de cultivo a fin de lograr altos rendimientos. Por esta razón, una mejor comprensión de los efectos del manejo de cultivos sobre el perfil mineral de las semillas contribuye a una mejor expresión del potencial de los cultivos mediante el ajuste adecuado de las prácticas agronómicas individuales.

La combinación de análisis elemental y quimiometría representa un avance tecnológico importante en la ciencia de cultivos que permite mejorar los rendimientos basados en herramientas estadísticas sin pérdida de gastos en el tratamiento de suelos o plantas.

4.4. Del efecto de la topografía

El análisis del perfil elemental permitió obtener modelos que pueden ser útiles para evaluar, de manera indirecta, la calidad del suelo y las estrategias agronómicas para predecir y mejorar los rendimientos potenciales de los cultivos de maíz cuando los suelos tienen diferentes condiciones topográficas.

El análisis elemental combinado con el análisis quimiométrico permite corregir las deficiencias minerales y proporcionar herramientas para mejorar la cosecha. Sin embargo, se recomiendan más estudios considerando el efecto del origen geográfico, el año de cosecha y otras fuentes no contempladas en este trabajo.

4.5. Del análisis elementómico realizado sobre tecnologías híbridas de maíz

Determinar el contenido mineral presente en tejido foliar de maíz resulta una técnica diagnóstica del estado nutricional de la planta, ya que es la hoja la que mejor manifiesta dicho estado nutricional, debido a que es ahí donde se produce la elaboración de las sustancias necesarias para el crecimiento y la fructificación. De esta manera, el análisis foliar también se puede emplear como práctica preventiva y de control de calidad, además de ser utilizado como índice de contaminación ambiental. Por su parte, el estudio elemental combinado con análisis multivariado, aplicado a hoja y semillas, permitió realizar un estudio elementómico de maíz, pudiéndose describir de manera sencilla los mecanismos de translocación de ciertos elementos a lo largo de la planta. A partir de los modelos multivariado obtenidos a través del análisis de componentes principales (PCA) y el análisis de discriminante lineal (LDA), fue posible clasificar dos tecnologías genéticas de maíz en dos tejidos vegetales diferentes, con un alto porcentaje de clasificaciones correctas para ambos casos, permitiendo, por un lado, discriminar muestras procedentes de las tecnologías Monsanto y Syngenta; y por el otro, realizar un estudio elementómico, mediante el análisis de translocación de minerales a lo largo de la planta.

4.6. Conclusión General

La presente tesis ha descripto de manera exhaustiva, cómo la utilización de un método instrumental como MPAES para determinar el perfil elemental en semillas y hojas de maíz, es capaz de brindar información sumamente útil con relación a parámetros de calidad de la planta, cuando dichos datos son adecuadamente tratados mediante herramientas quimiométricas de análisis.

Si bien la disponibilidad de muestras empleadas para la obtención de ciertos modelos quimiométricos fue baja en términos de representatividad, resulta importante resaltar que los resultados alcanzados han permitido evaluar una gran cantidad de propiedades que permitieron una adecuada discriminación de maíz según los factores estudiados.

Por otra parte, se propuso el desarrollo de un nuevo método de pretratamiento de muestra que, si bien presenta menor precisión en relación con el sistema convencional microondas, posee como cualidades sobresalientes la gran cantidad de muestras que se pueden analizar por unidad de tiempo, así como el bajo coste de implementación.

Por todo lo expuesto, esta tesis tuvo como propósito principal, el desarrollo de sistemas de análisis confiables aplicados en forma exclusiva a maíz, cultivo que fue analizado bajo la influencia de diferentes situaciones ambientales, así como bajo distintos factores genéticos relacionados a tecnologías híbridas, pudiendo de esta manera aportar nuevo conocimiento sobre este cereal, el cual es uno de los pilares económicos de Argentina en términos de producción nacional de granos.

Índice temático

FIGURAS

Figura 1.1 Localización de las áreas productoras de maíz en Argentina

Figura 1.2 Partes que componen a la planta de maíz

Figura 1.3 Partes que componen a la planta de maíz

Figura 1.4. Proceso de emisión en el MPAES

Figura 1.5 Esquema de calentamiento de muestra convencional (izquierda) y por microondas (derecha)

Figura 1.6 Ciclos de expansión compresión de una burbuja producida en el seno del líquido, por ultrasonido

Figura 1.7 Representación esquemática de la descomposición de la matriz X (I x J) en la matriz de scores T y la matriz ortogonal de los loadings P

Figura 1.8 Proyección de los objetos, definidos en el espacio tridimensional, en el plano formado por las dos primeras componentes principales (A=2)

Figura 1.9 Ecuación 1.2

Figura 1.9 Porcentaje de varianza explicada en función del número de componentes principales

Figura 1.10 RMSECV en función del número de componentes principales

Figura 1.11 Dendograma obtenido para un análisis de clusters hipotético

Figura 1.12. Gráfico de las dos primeras funciones discriminantes

Figura 2.1 Espectrómetro de Emisión Atómica marca Agilent MP 4100 y autosampler Agilent SPS3

Figura 2.2 Digestor microondas Anton Paar MW 3000

Figura 2.3 Sitios de muestreo de maíz en la provincia de La Pampa

Figura 2.4 Muestras de grano de maíz molidas

Figura 2.5 Muestras de hojas de maíz molidas

Figura 3.1 Diagrama óptico interno del MPAES

Figura 3.2 Posición de visualización en MPAES en función de SBRB (relación señal a fondo) para obtener la señal analítica óptima

Figura 3.20 Gráfico scores donde se observan los dos grupos definidos por la tecnología empleada

Figura 3.3 Cambios en la señal analítica al aumentar la presión del nebulizador en función de SBRB (relación señal a fondo)

Figura 3.4 Diferentes intensidades de señal analítica a diferentes longitudes de onda para el elemento Zn

Figura 3.5 a. Tratamiento convencional, MW. b. Tratamiento ineficaz. c. Tratamiento propuesto

Figura 3.6 Concentraciones encontradas y sus respectivas barras de error para muestras tratadas con MW y US

Figura 3.7 Correlación entre las concentraciones encontradas en las muestras para los dos pretratamientos

Figura 3.8 Concentraciones del MRC y concentraciones halladas luego de ser tratada con US

Figura 3.9 Gráfico de scores discriminante: distribución de las muestras de maíz en el espacio definido por las dos funciones discriminantes del LDA, mostrando la clasificación según la marca comercial: Sciences (A), Monsanto (B), Syngenta (C), KWS (D), Pioneer (E) y Don Mario (F)

Figura 3.10. Gráfico de scores (izquierda) para la discriminación según la densidad. A) 25,000; B) 35,000 y C) 45,000 semillas ha; Gráfico de loadings (derecha) muestra la influencia de las variables originales en el modelo

Figura 3.11. Dendograma obtenido por CA para las diferentes densidades

Figura 3.12 Gráfico de scores (arriba) para la discriminación según diferentes fertilizantes. A) PDA; B) PDA-U; El gráfico de loadings (abajo) muestra la influencia de las variables en el modelo

Figura 3.13 Dendograma obtenido por CA para los diferentes fertilizantes aplicados

Figura 3.14 Gráfico scores donde se observa el efecto de la topografía

Figura 3.15 Grafico de loadings de PCA donde se muestran la influencia de las variables originales en el modelo obtenido

Figura 3.16 Agrupamiento obtenido por CA

Figura 3.17 Gráfico scores donde se observan los dos grupos definidos por la tecnología empleada

Figura 3.18 Gráfico de loadings de PCA donde se muestran la influencia de las variables originales en el modelo obtenido

Figura 3.19 Gráfico scores donde se observan los dos grupos definidos por la tecnología empleada

TABLAS

Tabla 1.1:Datos de actualizados por la Bolsa de Comercio de Rosario para las campañas de maíz en los últimos años

Tabla 2.1.Número de muestras correspondiente a cada sitio de muestreo

Tabla 2.2.Rampa de calentamiento en digestor MW para granos de maíz

Tabla 2.3.Rampa de calentamiento en digestor MW para hojas de maíz

Tabla 3.1 Parámetros optimizados para la determinación de metales por MPAES

Tabla 3.2. Rectas de calibración para los diferentes analitos y sus respectivas longitudes de onda

Tabla 3.3. Cifras de mérito obtenidas para los analitos estudiados

Tabla 3.4 Comparación de los métodos de mineralización por horno microondas (MW) y el método propuesto asistido por ultrasonido (US)

Tabla 3.5. Resultados de la validación analítica del método propuesto

Tabla 3.6. Concentraciones promedio de las 86 muestras de granos de maíz analizadas por MPAES

Tabla 3.7: Grado de recuperación obtenido (n=10)

Tabla 3.8. Marca comercial y variedades de granos de maíz, y rótulos correspondientes

Tabla 3.9. Funciones discriminantes mostrando su significancia mediante la función Lambda de Wilks y sus correspondientes valores de probabilidad

Tabla 3.10. Coeficientes de las funciones discriminantes

Tabla 3.11. Resultados de la habilidad de clasificación del modelo LDA para los granos de maíz de acuerdo con su marca comercial

Tabla 3.12. Contenido mineral de las semillas de maíz en las densidades de siembra

Tabla 3.13. Contenido mineral de las semillas de maíz dependiendo el fertilizante aplicado

Tabla 3.14. Determinación multielemental en muestras de granos de maíz

Tabla 3.15 Tabla de confusión, LDA realizado en muestras

Tabla 3.16. Cifras de mérito obtenidas en muestras de hojas de maíz

Tabla 3.17. Concentraciones promedio de las muestras de hojas de maíz analizadas por MPAES (n =3)

Tabla 3.18 Tabla de confusión. LDA realizado en muestras

Tabla 3.19. Tabla 3.19: Concentraciones promedio de las muestras de semillas de maíz analizadas por MPAES (n =3)

Tabla 3.20 Tabla de confusión. LDA realizado en muestras de semillas